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Autor: Laura A. Svetaz, Rosanna N. Pioli, Susana A. Zacchino, Elisa Petenatti. Fac. Cs. Bioquímicas y Farmacéuticas U.N.R,
INTRODUCCIÓN
La soja (Glycine max L. Merr.) es una fuente primaria de aceite y de proteínas, y los
productos derivados son muy importantes en la formulación de nuevos alimentos de bajo
costo, nutricionalmente balanceados y de alto contenido proteínico1. Desafortunadamente,
la soja es frecuentemente afectada por infecciones fúngicas durante el cultivo y postcosecha,
afectando severamente su productividad y comercialización2. Dada la gran
diversidad de ambientes en los que la soja se cultiva, la importancia económica de estas
enfermedades varía con cada región, con las distintas prácticas de manejo de granos, de
cultivos y con el agente causante de la enfermedad2. Condiciones climáticas de alta
humedad y temperaturas superiores a 25ºC, durante el período de maduración y
precosecha del cultivo afectan a la madurez fisiológica y la sanidad de las semillas3. La
disponibilidad y distribución de semillas con sanidad aceptable constituyen uno de los
factores más importantes para obtener una mayor productividad en el cultivo de soja; dado
que las semillas y los rastrojos infectados son la principal fuente de infección4. La
obtención de nuevos antifúngicos efectivos y de amplia actividad, menos tóxicos y seguros
para el ambiente son aun necesarios para combatir las infecciones producidas por hongos
fitopatógenos5. Las fuentes potenciales de metabolitos antifúngicos naturales son las
plantas de la flora autóctona. Zuccagnia punctata Cav. (Fabaceae, Caesalpinoideae,
Caesalpinieae) es una especie monotípica de la región del centro y oeste de Argentina9,10
seleccionada por la capacidad de inhibir el crecimiento de hongos fitopatógenos11. El
objetivo del trabajo fue aislar e identificar compuestos antifúngicos de Zuccagnia punctata
que inhiban a los hongos causales de Enfermedades de Fin de Ciclo (EFC) y otras
patologías relevantes en el cultivo de soja de Argentina6,7,8.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material Vegetal:
Hojas y tallos pequeños de Z. punctata Cav. fueron recolectados en el Departamento
Belgrano, Pcia. de San Luis, Argentina, en abril de 2001. El material vegetal fue
identificado por L. A Del Vitto y E. Petenatti y un voucher specimen fue depositado en el
Herbario de la Universidad Nacional de San Luis (Del Vitto y Petenatti #9230, UNSL).
Extracción y Aislamiento:
Las partes aéreas secadas al aire (655 g) fueron molidas y sometidas a extracciones
repetidas con EtOH a temperatura ambiente (3 x 800 ml, 24 hs cada una). Se juntaron los
extractos y el solvente fue evaporado bajo presión reducida a 40ºC, dando 168 g de un
extracto EtOH semisólido (25% p/p con respecto al material de partida seco).
Una muestra de 40 g del extracto EtOH fue disuelto en 260 ml de EtOH / H2O 78:22 y
sucesivamente particionado con n-Hexano (3 x 130 ml), CHCl3 (3 x 130 ml), y n- BuOH (4
x 50 ml), para dar, luego de concentrar bajo presión reducida, 3,7 g de extracto hexánico,
14.57 g de extracto clorofórmico, y 1.94 g de extracto butanólico.
Una muestra de 1 g del extracto CHCl3 fue cromatografiado en Silica Gel 60H y eluído
sucesivamente con CHCl3, CHCl3 / EtOAc, EtOAc, MeOH, MeOH / H2O, y H2O. Las
fracciones fueron analizadas por Cromatografía en Capa Delgada, con distintas fases
móviles y usando luz UV o p-anisaldehido sulfúrico como agentes reveladores. Cada
fracción fue concentrada hasta sequedad en vacío y ensayada para su actividad
antifúngica. Repetidas columnas cromatográficas de las fracciones activas condujeron al
aislamiento de tres compuestos conocidos (1, 2 y 3) y dos compuestos nuevos (4 y 5). Se
estimó el rendimiento de extracción de cada uno de los compuestos. Las Chalconas 1
(41.9 mg, 0.38% p/p en términos del material de partida seco) y 2 (16.4 mg, 0.15% p/p en
términos del material de partida seco) y la flavanona 3 ( 6.6 mg, 0.06% p/p en términos del material de partida seco) fueron identificados por comparación de sus datos
espectroscópicos con aquellos reportados en la literatura12. El compuesto 4, 1-metil-3-(4′-
hidroxifenil)-propil cafeato tuvo un rendimiento de 19.3 mg (0.17 % p/p en términos del
material de partida seco), y el compuesto 5, 1-metil-3-(3′,4′-dihidroxifenil)-propil cafeato un
rendimiento de 17.9 mg (0.16 % p/p en términos del material de partida seco).
Microorganismos y Medio:
Los hongos utilizados para las pruebas antifúngicas fueron aislados de plantas
sintomáticas de diferentes cultivares y recolectadas en distintas localidades de las Pcias.
de Santa Fe (Bigand, Casilda, Classon, Barrancas) y Buenos Aires (Pergamino, San
Pedro), Argentina. Se evaluó la incidencia de las enfermedades y su localización en tallos,
frutos y semillas. Los tejidos fueron desinfectados superficialmente con hipoclorito de
sodio al 2% durante un minuto. Los patógenos fueron aislados usando el test de
incubación13 en las siguientes condiciones: Placas conteniendo medio de cultivo Agar
Papa Glucosa Acidulado (APGA). La incubación se realizó durante 7 días a 25 ± 2 ºC, con
alternancia de 12 h de luz cercana a UV y 12 h de oscuridad. Los aislamientos puros
fueron repicados en medio Agar Papa Glucosa Acidulado (APGA), con 1.6% de glucosa y
2% de ácido láctico (medio empobrecido con bajo porcentaje de glucosa) y en medio Agar
Agua (AA), con 2% de agar (medio mínimo) a 25 ± 2 ºC para promover la fructificación14.
Las colonias y cuerpos fructíferos fueron examinados en una lupa estereoscópica (×40,
CETI, Belgium) y las esporas fueron examinadas usando un microscopio óptico (×400,
×600 y ×1000), para poder ser caracterizados e identificados. La identidad de los hongos
fue verificada de acuerdo a Barnet y Hunter15, Domsch16, y Nelson et al.17, y nombrados
de acuerdo a Rossman et al.18 y Hawksworth et al.19. Los patógenos aislados fueron
depositados en el Centro de Referencia en Micología, FCByF.UNR.
Los siguientes aislamientos fúngicos fueron obtenidos de frutos y semillas de soja:
Phomopsis longicolla Hobbs (CE117-2001); Alternaria alternata (Fr.) Keissler (CE172-
2001); Fusarium equisetti (Corda) Sacc (CE181-2001), Colletotrichum truncatum (Schw.)
Andrus y W.D. Moore (CE175-2001), Aspergillus flavus, Nigrospora orizae. Un aislamiento
de Sclerotium bataticola Taub. (CE173-2001) obtenido de tallos de soja, y cuatro
aislamientos de Fusarium graminearum (Schw.) (CE170-2001, CE171-2001, CE169-2001,
y CE135-2001) también fueron evaluados.
Ensayos Antifúngicos:
La actividad antifúngica se determinó en base al Método de dilución en agar. Se
realizaron diluciones de la muestra original y cada una fue inoculada con el hongo a
probar. Se determinó la concentración inhibitoria mínima (CIM), que es la menor
concentración de extracto o compuesto a la cual se inhibe el crecimiento del
microorganismo. Tiene la ventaja de ser cuantitativo y poder ser usado tanto con muestras
solubles en agua como lipofílicas20 Durante el proceso, se hicieron diluciones sucesivas
de los extractos y compuestos puros a partir de 1000 y 50 μg/ml respectivamente,y fueron
incorporados dentro de medios de cultivo de acuerdo a los procedimientos reportados20, 21.
Los extractos y compuestos puros con valores de CIM >1000 ó >50 μg/ml
respectivamente fueron considerados inactivos. Las suspensiones de esporas fueron
obtenidas de acuerdo a los procedimientos reportados22 y ajustadas a 106 con habilidad
de formar colonias /ml.
Las soluciones stock de extractos en dimetil sulfóxido (DMSO) fueron diluidas para dar
diluciones seriadas que fueron agregadas a cada medio resultando en concentraciones
que iban desde 0.24 a 1000 μg/ml (o 0.20-50 μg/ml para compuestos puros). La
concentración final de DMSO en el ensayo no deberá exceder el 2%. Usando una
micropipeta, un inóculo de 5 μl de esporas o suspensión micelial fueron agregados a cada
tubo conteniendo 500 μl de medio.
Los antifúngicos estrobirulinas Pyraclostrobin (MC Comet, BASF, Buenos Aires,
Argentina) y Azoxystrobin (Amistar, Syngenta, Buenos Aires, Argentina) así como también
los azoles metil benzimidazol-2-ylcarbamato (Carbendazim,Agar Cross, Rosario,
Argentina) y ketoconazol (Sigma, MO) fueron incluidos en el ensayo como controles
positivos. Medio libre de droga fue usado como un control negativo. Las placas fueron
incubadas por 48 ó 72 h, a 28 ºC (de acuerdo al control de crecimiento del hongo).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El extracto EtOH de partes aéreas secas de Z. punctata mostró actividad frente a todos
los hongos evaluados, con CIMs entre 62.5 y 500 μg/ml, siendo N. orizae, P. longicolla y
C. truncatum las especies más susceptibles.
Este extracto fue sucesivamente particionado entre n-Hexano, CHCl3 y n-BuOH, siendo el
extracto clorofórmico el que mostró los menores valores de CIM frente a los hongos
patógenos de soja; con valores entre 62.5 y 250 μg/ml. El fraccionamiento cromatográfico
del extracto clorofórmico guiado por actividad, dio lugar al aislamiento de cinco
compuestos puros, dos de ellos son nuevos ésteres del ácido caféico28.
La tabla 1 muestra las actividades antifúngicas (valores de CIM en μg/ml) de los
compuestos 1 al 5 aislados a partir de Z. punctata, frente a todos los hongos aislados.
Tabla 1: Estructura y actividad antifúngica de los compuestos aislados de Z. punctata usando el
método de dilución en agar.
A.f.: Aspergillus flavus; N.o.: Nigrospora oryzae; P.l.1: Phomopsis longicolla (CE117); P.l.2: Phomopsis longicolla
(M3); A.a.: Alternaria alternata (CE172); S.b.: Sclerotium bataticola (CE173); F.e.: Fusarium equiseti (CE181);
F.g.1: Fusarium graminiarum (CE170); F.g.2: Fusarium graminiarum (CE171); F.g.3: Fusarium graminiarum
(CE169); F.g.4: Fusarium graminiarum (CE135); C.t.1: Colletotrichum truncatum ( San Pedro); C.t.2:
Colletotrichum truncatum (Casilda); C.t.3: Colletotrichum truncatum (Classon). (CE175)
1: 2',4'-dihidroxi-3'-metoxichalcona 2: 2',4'-dihidroxichalcona 3: 7-hidroxiflavanona 4: 1-Metil-3-(4'-hidroxifenil)-
propilcafeato 5: 1-Metil-3-(3', 4'-dihidroxifenil)-propil cafeato; Pyr.: Pyraclostrobin; Carb.: Carbendazim; Azo.:
Azoxystrobin. Ket.: Ketoconasol
Los datos indican que particularmente las dos chalconas (compuestos 1 y 2) tienen
considerable actividad in vitro contra la mayoría de los hongos evaluados, con CIMs entre
1,56 y 50 μg / ml. Los compuestos 3 y 4 mostraron actividades muy interesantes solo
frente a P. longicolla (CIM= 6.25 μg / ml), mientras que el compuesto 5 no mostró ninguna
actividad, con CIM > 50 μg / ml.
…Es interesante notar que cuatro de los cinco compuestos aislados a partir del extracto
clorofórmico de Z. punctata desarrollaron muy buenas actividades (CIM ≤ 6.25 μg / ml)
frente a P. longicolla. Este hongo es el agente causal del decaimiento y deterioro de
semillas, una patología altamente severa que afecta la calidad y el rendimiento de las
semillas de soja23. En Argentina, este patógeno fue aislado y cuantificado en frutos y
semillas de soja industrial y verde (consumo fresco), a partir de diferentes localidades del
área de producción24, 25. Las semillas infectadas son arrugadas, resquebrajadas y de
aspecto blancuzco. Cuando la soja madura en climas templado-húmedos y la cosecha es demorada, el decaimiento de semillas asociado con el tizón del tallo y de la vaina puede
disminuir la viabilidad de las semillas24, 26.
Ninguno de los extractos y compuestos fueron efectvos frente a A. flavus.
Las chalconas 1 y 2 mostraron marcada actividad frente a Colletotrichum truncatum
(CIM= 6.25 μg / ml). C. truncatum es el agente causal de la Antracnosis de soja y
constituye el complejo de EFC, infecta tallos y vainas disminuyendo el número y peso de
sus semillas.
C. truncatum y P. longicolla, EFC relevantes por su frecuencia y niveles de intensidad en
tejidos de soja14, 27, y Nigrospora orizae, patógeno de maíz y soja, fueron los hongos más
sensibles a estos compuestos. Estos resultados proveen un punto de partida para la
obtención de nuevos compuestos antifúngicas a partir de nuestra flora nativa28.
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Autor: Laura A. Svetaz, Rosanna N. Pioli, Susana A. Zacchino, Elisa Petenatti. Fac. Cs. Bioquímicas y Farmacéuticas U.N.R,
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