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Autor: Jesús Rojas-Jaimes - EFADAEXPORT- Laboratorio de Microbiología y Micotoxinas
Fecha de Publicación: 23/06/2008
Responsable: Jesùs Rojas Jaimes
Comparación entre los sistemas ELISAS y el HPLC usando los kits de NEOGEN “VERATOX” y R-BIOPHARM para análisis de ocratoxina en muestras de páprika
Lima - Perú
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Las micotoxinas han tomado relevancia a nivel mundial especialmente las aflatoxinas por su poder carcinogénico así ocratoxina es otra micotoxina de relevancia que ha demostrado toxicidad en animales, la comunidad europea ha impuesto limites permisibles para la concentración de ocratoxina presente en alimentos.
En este trabajo se evaluó el parámetro principal de confiabilidad del elisa Veratox Neogen y el elisa kit R-Biopharm como repetibilidad, así también los resultados del elisa se compararon con la prueba referencial HPLC(Cromatografía liquida de alta performancia) obteniendo coeficientes de variación para el kit Neogen Veratox de repetibilidad 67.8% y 10.1% máximo y mínimo respectivamente, usando el kit de R-Biopharm se obtuvo los coeficientes de variación máximo de 8.3% y coeficiente de variación mínimo de 1.9% respectivamente.
El coeficiente de correlación entre los ELISAs y el HPL fueron: usando el kit Veratox Neogen fue de 0.91 y usando el kit Biopharm fue de 0.8 (Evaluados en Perú).
La mejor correlación entre el elisa y el HPLC fue usando el kit “Veratox” Neogen con un valor de 0.91.
INTRODUCCIÓN
Ocratoxina es una toxina fungica producida por Aspergillus y Penicillium esta micotoxina se encuentra en un amplio numero de alimentos (Haggblom-1982). Estas toxinas son producidas como respuesta al estrés contrario a las condiciones de crecimiento, esta micotoxina de carácter apolar se divide en A, B y C .Su carácter químico la hace estable a autoclave observando un residuo de esta hasta después de 3 horas de haberla sometido a esterilización sin embargo es inestable a la luz (Carrillo 2003).
En el área patológica una aguda necrosis hepática fue observada como un efecto de Ocratoxina A asi los derivados de Ocratoxina A como el etil ester “Ocratoxina C” se a reportado ser toxico el derivado dicloro de Oratoxina A “Ocratoxina B” no se ha reportado toxicidad (Peckham 1971).
La validación de un método es un proceso que se realiza para evaluar si el método en estudio será confiable cuando se realice los exámenes.
La validación este basado en varios parámetros como muestreo, especificidad, aplicabilidad, rangos de concentración, agudeza, precisión y selectividad (Horwitz-2003).
Neogen y Biopharm son 2 Compañías que distribuyen pruebas de kits elisa para el análisis cuantitativo de Ocratoxina el presente estudio se ha propuesto como finalidad evaluar la confiabilidad de estos kits comparado al método referencial HPLC.
MATERIALES Y METODOS
1.-Método de muestreo
-Se tomo muestras de 100 gr a cada saco a un total de 80 sacos que equivalen a 2 toneladas.
-Se procedió a la pulverización de los 8 kilogramos de .
-Se mando una muestra de 300 gr laboratorio con una contra muestra que se almaceno.
-Se analizo 17(codificadas del numero 1 al 17) muestras con el Kit VERATOX Quantitative Ochratoxin Test y paralelamente se analizo por HPLC las contra muestras de las muestras analizadas por ELISA.
2.-ELISAVERATOX NEOGEN
-Se realizo el analisis de las muestras de páprika usando el kit elisa veratox NEOGEN (EFADA) sin columnas
-Se realizo la lectura a 650 nm en un espectrofotómetro.
-Los datos obtenidos fueron pasados al Software RIDAWIN EXE multiplicándolos por el factor 2 generando resultados en ppb.
3.-elisa Fast OCHRATOXIN (BIOPHARM) usando columnas de inmunopurificaciòn (RIDA-BIOPHARM)
-Se midió los resultados a 450nm a los 3 minutos de parada la reacción
4.-Pruebas estadísticas
-Se realizo una prueba de “T” de Student y una correlación en EXEL entre los métodos elisa y HPLC.
5.-Detección de ocratoxina por cromatografía liquida de alta performancia (HPLC)
Las contramuestras de cada muestra analizada por elisa se enviaron a los Laboratorios de GBA (Alemania) y Certified Laboratorios Inc (Estados Unidos) para el análisis por HPLC.
6.-Prueba interlaboratorios
- Se selecciono 4 muestras analizadas por HPLC y se envió para ser analizadas por ELISAS y HPLC a Tecna (Italia),Biopharm(Alemania) y Neogen(Estados Unidos –solo ELISA)
RESULTADOS
elisa NEOGEN
Tabla 1.-Muestras en par para observar repetibilidad de la prueba (1-2)M1, (3-4)M2,(5-6)M3,(7-8)M4,(9-10)M5,(11-12)M6,(13-14)Interferencia.
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Tabla 2.-Los datos muestran resultados apareados. R1, R2=Aflatoxina 8ppb-R3-R4=Interferencia, R5, R6=Muestra 7-R7, R8=Muestra 8-R9, R10-Muestra 9-R11, R12=10-R13, R14=11.
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Tabla 3
T STUDENT
Saco un “T “experimental:
t0,05(2)(18)=0,86
ttabla=2,101
Entonces se acepta H0 y se rechaza H 1 y se concluye que no existen diferencias.
Tabla 4 Correlación elisa NEOGEN (EFADA EXPORT)-HPLC
Índice de correlación =0.91
elisa BIOPHARM (C)
elisa BIOPHARM(C) –REPETIBILIDAD- E INTERFERENCIA
Tabla 5.- R1,R2=Muestra 1-R3,R4=Muestra 4-R5,R6=Muestra 5-R7,R8=Muestra 6-R9,R10=Muestra 7-R11,R12=Muestra 11-R13,R14=Muestra 11 Sin columnas R15,R16=0ppb Aflatoxina-R17,R18=40.5ppb Aflatoxina-R19=Interferencia .
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Tabla 6 Índice de correlación entre elisa BIOPHARM (EFADA) Y HPLC
Índice de correlación =0.8
Tabla 7 Comparación entre ELISAS realizados en el extranjero (Reproducibilidad) y el HPLC
DISCUSIONES
a) Para el Kit Veratox Neogen se observo una variación máxima de 6,21ppb (Tabla 1) con 67,8% de coeficiente de variación y variación mínima 10,1% de coeficiente de variación (Tabla 2) en la repetibilidad esto se debe al error en la manipulación del personal de laboratorio, se observo una disminución del coeficiente de variación al incrementar el cuidado en la realización del elisa. Esta variación solo se circunscribe a los resultados que están dentro del rango de confiabilidad (Negro).
b) Para el kit de R-Biopharm se obtuvo los coeficientes de variación máximo de 8.3% y mínimo de 1.9%.(Tabla 5). Esto es debido a la mejor manipulación en el análisis de ocratoxina cuando se realizo
a) La prueba estadística del T de Student para Veratox Neogen dio como resultado que no existía diferencias significativas entre los métodos de análisis para micotoxinas (ELISA-HPLC) donde t0,05(2)(18)=0,86
ttabla=2,101 aceptando H0 ,en el análisis de correlación entre el elisa Veratox Neogen y el HPLC se obtuvo el índice de correlación = 0.91(EFADA) y el índice de correlación realizado por Laprovet fue de 0.9999 (6 muestras),destacando una buena correlación entre métodos analíticos afianzando el resultado que se obtuvo por el T de Student.((Tablas 3 y 4).La mejor correlación mostrada por Laprovet posiblemente se deba a un mejor desarrollo del protocolo por parte del experimentado investigador.
b) Para el análisis de correlación entre el kit Biopharm(C) y el HPLC se obtuvo el índice de correlación =0.8 (Tabla 6)
a) En la prueba de comparación entre el kit R-Biopharm(C) (Alemania) y el HPLC existió una variación promedio de 5,94 ppb. (Tabla 7)
b) En la comparación entre el kit Veratox-Neogen (C) (Estados Unidos) y el HPLC existió una variación promedio de 15.4ppb, sin embargo en este ensayo los resultados por ELISAS fueron menores a los del HPLC posiblemente a la heterogeneidad de la ocratoxina en las muestras. (Tabla 7)
-Las pruebas usando el elisa Veratox Neogen(C) (USA) dio resultados mas lejanos al HPLC comparados al elisa R- Biopharm (C)(GERMANY), posiblemente a una mala metodología en la realización del elisa ,el elisa Tecna (C-Romer) mostró los resultados mas lejanos respecto al HPLC referencial, es posible que se haya usado una metodología incorrecto y/o las columnas usados estuvieran dañadas. (Tabla 7)
CONCLUSIONES
-La variación usando el kit Veratox Neogen por error de manipulación en el laboratorio en la prueba de elisa fue de 67.8% coeficiente de variación como máximo y 10.1% coeficiente de variación como mínimo en los resultados dentro del rango de confiabilidad (color negro) ,el coeficiente de variación disminuyo cuando se realiza una buena metodología del procedimiento de elisa pudiéndose obtener resultados confiables.
Usando el kit R-Biopharm se obtuvo los coeficiente de variación máximo de 8.3% y coeficiente de variación mínimo de 1.9%.
Se debe realizar como mínimo una repetibilidad por muestra para la obtención de resultados confiables.
-El PBS OXOID ayuda a mantener el pH entre 6-6.5 en las soluciones de extracción siendo favorable para las reacciones en el ELISA.
-En la evaluación del uso de columnas de inmunopurificaciòn R-Biopharm no se obtuvo resultados contundentes debido a que en las pruebas realizadas en EFADA no existió una diferencia significativa, sin embargo en las pruebas realizadas por La Ensenada si resulto significativa la diferencia en el uso de las columnas(Datos no mostrados).
-Se observo que los resultados de elisa tienden a ser más altos a los de HPLC.
-Se obtuvo una buena correlación entre el elisa Veratox-Neogen y el HPLC (0.9) obteniéndose con este último kit un mayor índice de correlación comparado al kit R-Biopharm-HPLC (0.8).
-En la prueba de comparación entre el kit R-Biopharm(C) (Alemania) y el HPLC (Alemania ) existió una variación promedio de 5,7ppb ,en la comparación entre el kit Veratox-Neogen(C) (Estados Unidos) y el HPLC existió una variación promedio de 15.5ppb , corroborando la variación entre el elisa y el HPLC respecto a los datos obtenidos en EFADA EXPORT(Perú).
-El mejor resultado por HPLC realizado en el extranjero comparado al HPLC referencial fue el realizado por PROGETTO NATURA (Italia) con un coeficiente de correlación de 0.99406148 (3 muestras no representativa)(Datos no mostrados)
- Las pruebas usando el elisa Veratox Neogen(C)(USA) y elisa Tecna(C) (ITALY) dio resultados mas lejanos al HPLC referencial comparados al elisa R- Biopharm (C)(GERMANY-4 muestras-no representativa).Por lo tanto mejor resultado se obtuvo usando el elisa R-Biopharm(C) obteniendo 0.96 de correlación.
-Los mejores resultados obtenidos en Perú respecto al HPLC referencial fue el elisa Veratox Neogen(Laprovet) con un coeficiente de correlación 0.9999 (6 muestra-no representativas) sin usar columnas de inmunopurificaciòn.
BIBLIOGRAFIA
1.-Peckhman Jhohn ,Jones Oscar ,Doupnik Jr., Acute Toxicity of Ochratoxins A and B in Chicks'.(1971).Applied Microbiology.Pgs: 492-494.
2.-Haggblo Per .Production of Ochratoxin A in Barley by Aspergillus ochraceus and Penicillium Effect of Fungal viridicatum: Growth, Time,Temperature, and Inoculum Size.(1982). Applied and Environmental Microbiology .Pgs: 1205-1207.
3.-Chu F.S,Chang Fred,Hinsdill Ronald.Production of Antibody Against Ochratoxin A.(1976).Applied and Environmental Microbiology.Pgs:831-835.
4.-Horwitz William .AOAC International.(2003).
5.-Gillespie J.,Schwarz P.,Mostron M.,Tacke B.,Dong Y.,Hart P.,Munn B.,Update on Uswbsidon Diagnostic Laboratories.(2003).National Fusarium Head Blight Forum Proceedings.
6.-Mèlotte L.,Survey on Analyisis of Mycotoxins.(2004).EBC Press Report.
7.-Medina Juan Carlos,Castillo Elizer,Joel Muñoz,Miguel Romero.Problemas en la Cuantificicaciòn de Micotoxinas y Niveles de Contaminación en Mexico.(1994). “Apoyo a las actividades regionales de acuicultura en America Latina y el Caribe”— AQUILA II.Accedido el 27/03/07 .Disponible en: http://www.fao.org/docrep/field/003/AB482S/AB482S14.htm.
8.-Medina Juan Carlos ,CastilloElizer. Determinación de Micotoxinas por Medio de Ensayos Inmunoquimicos .(1994). “Apoyo a las actividades regionales de acuicultura en America Latina y el Caribe” — AQUILA II. Accedido el 27/03/07 .Disponible en: http://www.fao.org/docrep/field/003/AB482S/AB482S15.htm#ch14.
9.- CIPAC, Guidelines on Method Validation to be performed in Support of Analytical Methods for Agrochemical Formulations. Collaborative International Pesticides Analytical Council.(1999). Document No. 3807, Black Bear Press, Cambridge.
10.- FAO/IAEA .Validation of analytical methods for food control.(1997).A Report of a Joint FAO/IAEA Expert Consultation..
11.- Mélotte L..Survey on the Analysis of Mycotoxins .( 2004 ). EBC PRESS REPORT
Autor: Jesús Rojas-Jaimes - EFADAEXPORT- Laboratorio de Microbiología y Micotoxinas
Fecha de Publicación: 23/06/2008
Responsable: Jesùs Rojas Jaimes
Comparación entre los sistemas ELISAS y el HPLC usando los kits de NEOGEN “VERATOX” y R-BIOPHARM para análisis de ocratoxina en muestras de páprika
Lima - Perú
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 DISCUSIONES SOBRE ESTE TEMA.
 
| 24/06/2008 |
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Luis Corado
Zootecnista
Guatemala - Guatemala |
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Tengo un par de comentarios:
1) El estudio se hizo en Paprika, que me imagino que es una materia prima. Estos resultados deberán ser validados para otras materias primas y en lo personal, no me arriesgaría a inferir que van a haber resultados similares en alimento balanceado. Pregunta: Tienen datos en alimento terminado?
2) Aún cuando estadísticamente se muestra que no se detectan diferencias significativas, es evidente que hay variaciones sustanciales entre la lectura elisa y HPLC. Sugiero que mantengamos en mente que siempre que analicemos resultados obtenidos por este método, existe una muy alta probabilidad de que tengamos sobrevaloraciones del contenido real de Ocratoxinas.
Les felicito por este trabajo que nos ayuda a documentar las diferencias que existen entre métodos de evaluación de micotoxinas. | Respuesta Chequeada por Engormix.com  |
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| 24/06/2008 |
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Estimado Sr. Rojas:
Realmente me sorprende que se puedan sacar conclusiones cuantitativas con coeficientes de variaciones que van desde 10 al 67 %. Cual es el valor que se tomó para compararlo con el HPLC? Con que criterio se tomo ese valor?
Por otro lado, en el caso de la comparación de los resultados con el kit de R-Biopharm, se han utilizado valores que están fuera del rango de cuantificación del software, por lo que son valores que no sirven a los efectos de realizar comparaciones cuantitativas. En esos casos, lo correcto es diluir la muestra para que el valor obtenido quede entre los valores del estandar 2 y 5 y luego multiplicar dicho valor por el factor de dilución correspondiente.
Atentamente,Dan Kaplan | | Respuesta Chequeada por Engormix.com |
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| 27/06/2008 |
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Buenos dias estimado Dr. Dan Ka plan:
Paso a responder :
1.-En general de prueba de repetibilidad se realizo con un subgrupo dentro del grupo de analisis de las muestras tanto para Veratox como para Biopharm.Sin embargo en algunas muestras de comparación entre el elisa y el HPLC el valor fue el promedio aritmético,el criterio fue sentido común.
2.-Respecto a los valores fuera de rango es cierto lo que usted indica ,sin embargo el programa indica valor aproximado,estas muestras fueron evaluadas para los 2 kits (Veratox y Biopharm), en Biopharm se uso columnas pensando en una dilución podría perderse muestra ,asi se deseo evaluar la practicidad de los ELISA.
Agradeciendo las criticas para poder superar los errores me despido afectuosamente.
Jesús |
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| 27/06/2008 |
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Buenas tardes estimado Luis Corado:
Le respondo que el analisis se uso en polvo de paprika Como alimento terminado.
Pase un buen dia.
Jesús |
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| 10/07/2008 |
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Luis Corado
Zootecnista
Guatemala - Guatemala |
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Gracias por la aclaración, pero me queda una confusión. Lo que para una industria es un alimento terminado, para otra puede ser una materia prima. Para aclarar esto, tengo un par de preguntas: El polvo de Paprica es un alimento terminado para alimentación animal? Me refiero a que si es un alimento balanceado o un concentrado que va a ser suministrado a los animales como base de la alimentación (o parte significativa)?
Gracias por su aclaración. |
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| 10/07/2008 |
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Julio Manuel
Callao - Perú |
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Estimado colega, ante todo te felicito por el tema ,que nos sirve a todos para discutir entre utilizar uno u otro kit de ELISA.
Mi pregunta va en que en tu discucion Seccion a) hablas de un error del analista ,tomaste en cuenta el calculo de incertidumbre para el analista encargado en en ealizar la prueba??? puesto al parecer esta incertidumbre es muy grande por lo que puedo ver en tus datos ,¿ crees que esto le reste credibilidad a tus resultados?.
Hasta pronto.
JULIO R. |
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| 24/07/2008 |
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Buenos dias estimados señores Luis y Manuel:
Señor Manuel:El polvo de paprika es un concentrado como condimento para consumo humano,no es una mezcla.
Señor Luis:No se realizo algún estadístico para evaluar incertidumbre,cuando me refiero a error de analista me refiero al cuidado en los lavados y en le procedimiento general del protocolos observo que esto cambia de un experimentador a otro en función a la experiencia,yo no creo que esto reste credibilidad al ensayo relevantemente si se realiza un ajuste del resultado con un promedio y el desarrollo del método por una persona calificada,caso contrario si puede ser relevante el error.No solo por estos factores también por el lugar donde se toma la muestra y otro como el tiempo ,recordemos que estamos cuantificando ppb.
Éxitos
Jesús |
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| 28/07/2008 |
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Manuel Mendoza
Guatemala - Guatemala |
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Es posible que la correlación sea válida para la determinación de Aflatoxina con Neogen elisa y algúna técnica cromatográfica equivalente con el mismo grado de correlación? |
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