Pasteurella multocida

Pasteurella multocida es el agente etiológico del Cólera Aviar. Además, P. multocida puede ser, tanto un agente patógeno primario, como un agente secundario asociado a otras enfermedades. La presentación de esta afección puede ser aguda, subaguda o crónica. La presentación aguda o subaguda está asociada con septicemia y alta mortandad mientras que los casos crónicos están asociados a infecciones locales en barbillones, senos paranasales, peritoneo, hígados, pulmones u ovarios (Boyce et al., 2004). En los casos crónicos de Cólera Aviar las aves suelen permanecer como portadoras y sufren reducción de la producción de huevos mientras que en las aves reproductoras la enfermedad causa también disminución de la fertilidad. La patogenicidad depende de la cepa aislada, del hospedador y de su estado sanitario (Glisson et al., 2008). Entre los factores de virulencia conocidos cabe mencionar la cápsula, los LPSs, las toxinas, el sistema de adquisición de hierro, las adhesinas y otras proteínas de membrana. Sin embargo, la participación de cada uno de estos factores no está totalmente dilucidada (Boyce et al., 2010).

Pasteur (1880) fue el primero en describir la disminución de la patogenicidad de P. multocida luego de pasajes en medios de cultivo artificiales y su posterior recuperación luego de pasajes in vivo. Por lo tanto, no es posible reproducir el Cólera Aviar sin antes establecer la dosis adecuada de inoculación. Si bien están descriptas algunas cepas altamente patógenas (Chung et al., 2001; Harper et al., 2007) hay diferentes descripciones sobre la patogenicidad de aislamientos locales de P. multocida.

El objetivo de este trabajo es conocer la patogenicidad de aislamientos locales de cepas de P. multocida para predecir su capacidad de causar mortandad y establecer un modelo estándar de reproducción experimental del Cólera Aviar adecuado para evaluar tratamientos preventivos o curativos.

Aves
Pollitos machos de ponedoras de 1 día de vida de la línea Hisex brown.

Cepas de Pasteurella multocida
Se utilizaron 10 cepas regionales de P. multocida del cepario del Laboratorio de Bacteriología del INTA EEA Balcarce (Tabla 1).

Tabla 1. Cepas de Pasteurella multocida

Inóculo
Las cepas fueron extraídas de viales congelados en nitrógeno líquido y sembradas sobre Agar Base Columbia con 7 % sangre bovina (ASC). Se incubaron durante 18 horas a 37ºC y de cada placa se transfirió una colonia a 10 ml de caldo infusión cerebro corazón. Este caldo se incubó durante 18 horas a 37ºC y fue directamente utilizado para inocular las aves.

Diseño Experimental
Ensayo 1: De cada una de las cepas se inyectaron por vía subcutánea 0,1 ml del inóculo desarrollado en caldo infusión cerebro corazón a 5 pollitos de 2 días de vida. Se registró la mortandad hasta las 24 horas post-inoculación. Se extrajeron los hígados de los pollitos muertos o sacrificados (a razón de 2 pollitos por cada cepa) mediante dislocación cervical (AVMA, 2007). Los dos hígados de cada lote fueron macerados manualmente en bolsas plásticas en PBS (pH 7,2) y sembrados en ASC y Agar Base para re-aislamiento de P. multocida y Agar MacConkey para control de posibles enterobacterias contaminantes.

Ensayo 2: De cada una de las cepas se inyectaron a 5 pollitos de 3 días de vida por vía subcutánea 0,1 ml del macerado de los hígados obtenidos en el Ensayo 1. Se registró la mortandad hasta las 24 horas post-inoculación, sacrificando a todas las aves que sobrevivieron. Se extrajeron todos los hígados de los pollitos muertos o sacrificados en cada lote. Los hígados fueron macerados y sembrados en forma similar a lo descripto para el Ensayo 1. Agrupando en conjunto los hígados de cada lote de aves, se realizaron recuentos de cada macerado por la técnica de Miles y Misra (1938) sobre placas de ASC.

Ensayo 3: Se seleccionaron las 5 cepas que causaron mortandad o septicemia en los ensayos anteriores. Estas 5 cepas se inocularon a 10 pollitos de 4 días de vida por vía subcutánea utilizando 0,1 ml del macerado de los hígados de cada lote que había sido obtenido en el Ensayo 2. Se registró la mortandad hasta las 24 horas post-inoculación y se sacrificaron todas las aves que sobrevivieron. Se extrajeron los hígados de los pollitos muertos o sacrificados. Los hígados fueron sembrados en forma similar a lo descripto para el Ensayo 1.

En el Ensayo 1, empleando los inóculos del caldo infusión cerebro corazón, provenientes de las cepas extraídas de nitrógeno líquido, sólo se observó mortandad en los Grupos 1 y 9 (respectivamente en 1 ave de 5 y en 2 aves de 5 (Tabla 2).

En el Ensayo 2, realizado mediante la utilización del macerado de los hígados provenientes del Ensayo 1 como inóculo, se observó mortandad en los mismos dos grupos anteriores (1 y 9). Por otro lado, se aisló P. multocida en cultivo puro de los macerados de los hígados de Grupos 8 y 10, aunque esta bacteria no causó mortandad. Además se encontraron 2 aves muertas por causas ajenas al ensayo en del Grupo 4 pero sin lograr el aislamiento de P. multocida en el macerado.

En el Ensayo 3 se utilizaron solamente 5 cepas que fueron seleccionadas por su aparente patogenicidad: 3 cepas que causaron mortandad (Grupos 1, 4 y 9) y 2 cepas que causaron infección hepática aunque sin producir mortandad (Grupos 8 y 10). El ensayo fue realizado mediante la inyección subcutánea de 0,1 ml del macerado de los hígados del Ensayo 2 conteniendo aproximadamente 10⁷ unidades formadoras de colonias por ave de P. multocida en cultivo puro. La mortandad registrada en Grupos 1 y 9 fue del 100 % mientras que en los otros 3 grupos inoculados se encontró sólo 1 pollito muerto en el Grupo 10. P. multocida fue aislada de los 5 pooles de hígados.

Tabla 2. Inóculos y mortandad de Pasteurella multocida

^A - Inóculos del caldo cerebro-corazón, provenientes de las cepas extraídas de nitrógeno líquido
^B - Macerado de los hígados del Ensayo 1 en PBS
^C - Macerado de los hígados del Ensayo 2 en PBS

Todas las cepas regionales utilizadas fueron aisladas de casos clínicos de Cólera Aviar y conservadas congeladas en nitrógeno líquido durante varios años. De acuerdo con los primeros trabajos de Pasteur (1980) los resultados obtenidos en el presente trabajo mostraron un aumento de la patogenicidad de algunas de las cepas de P. multocida estudiadas; así se demostró que luego de dos pasajes in vivo la mortandad en el Grupo 1 (cepa 1019) aumentó desde un 20 % al 100 % y en el Grupo 9 (cepa 2088) desde un 40 % al 100 %. Sin embargo, algunas de las cepas que se estudiaron mostraron capacidad de invasión de los hígados aunque sólo fueron capaces de causar mortandad baja o nula. Estas últimas cepas estaban generalmente asociadas a casos crónicos de Cólera Aviar, generando pérdidas por baja producción y fertilidad pero sin causar mortandad en las granjas. Sin embargo, cabe la posibilidad de que si se hubiera efectuado un mayor número de pasajes in vivo, estas mismas cepas podrían haber aumentado su patogenicidad.

AVMA Guidelines on Euthanasia (Formerly Report of the AVMA Panel on Euthanasia). Schaumburg, IL: AVMA.

Boyce JD, Lo RYC, Wilkie I, Adler B. 2004. Pasteurella and Mannheimia. pp. 385-396. En Pathogenesis of bacterial infections of animals, Gyles CL, Thoen CO, Prescott JF, Songer JG (eds.). Blackwell Publishing Ames, IA, USA.

Boyce JD, Harper M, Wilkie IW, Adler B. 2010. Pasteurella. pp. 325-346. En Pathogenesis of Bacterial Infections En Animals 4^th ed, Gelyes CL, Prescott JF, Songer JG, Thoen CO, Blackwell publishing Ames, IA, USA.

Chung JY, Wilkie I, Boyce JD, Townsend KM, Frost AJ, Ghoddusi M, Adler B. 2001. Role of Capsule in the Pathogenesis of Fowl Cholera Caused by Pasteurella multocida Serogroup A. Infect Immun 69:2487-2492.

Glisson JR, Hofacre CL, Christensen JP. 2008. Pasteurellosis and Other Respiratory Bacterial Infection: Fowl Cholera. pp. 739-758. En Diseases of poultry 12^th ed, Saif YM, Fadly AM, Glisson JR, McDougald LR, Nolan LK, Swayne DE. Blackwell publishing, Ames, IA, USA.

Harper M, Cox A, St. Michael F, Parnas H, Wilkie I, Blackall PJ, Adler B, Boyce JD. 2007. Decoration of Pasteurella multocida Lipopolysaccharide with Phosphocholine Is Important for Virulence. J Bacteriol 189:7384-7391.

Miles AA & Misra SS. 1938. The estimation of the bactericidal power of the blood. J. Hyg. 38:732-749

Pasteur L. 1880. De l''''atténuation du virus du cholera des poules. CR Acad Sci. 91:673-680.