Encuesta serológica preliminar del virus de la anemia infecciosa en aves domésticas y silvestres, de vida libre, en Argentina

Yuasa et al. reconocieron por primera vez en 1979 a la anemia infecciosa del pollo (CIA, por sus siglas en inglés) como una enfermedad nueva en pollos jóvenes, causada por un virus diferente (CIAV). Desde aquella primera descripción de la enfermedad y el aislamiento subsiguiente del virus en cultivo celular en Japón, se le ha encontrado prácticamente en todos los países donde existe una industria avícola. La anemia infecciosa se caracteriza por ser de tipo aplástica y por causar atrofia linfoide generalizada con inmunosupresión concomitante y, frecuentemente, complicada con infecciones secundarias, de tipo viral, bacteriano o micótico. El virus de la anemia infecciosa desempeña un papel de gran importancia en la etiología de diversas enfermedades multifactoriales asociadas con un síndrome hemorrágico y/o anemia aplástica. Además de la anemia y de los síndromes asociados con ella, la infección subclínica con este virus cursa sin anemia, pero produce un aumento en la mortalidad, cosa que se observa frecuentemente en parvadas comerciales (Schat y van Santen, 2008). En Argentina la enfermedad se identificó en 1991 y Buscaglia et al. (1994) aislaron el virus por primera vez. Desde entonces se han publicado informes de otros aislamientos (Buscaglia, 1996; 1999) y también se han caracterizado otros aislamientos (Craig et. al., 2009). En el IX Congreso Argentino de Virología, Buscaglia demostró la presencia de anticuerpos específicos contra el virus en gallinas de traspatio donadas a familias pobres bajo un programa social denominado Pro Huerta (Buscaglia, 2008). Se presentaron los resultados de pruebas serológicas de muestras procedentes de pollos de traspatio en diferentes sitios de la provincia de Buenos Aires, no relacionados con el citado programa, además de los procedentes de este trabajo social, aunque la información no se ha publicado aún (Buscaglia, 2010). Se obtuvieron más muestras de suero no relacionadas con este programa, procedentes de pequeñas parvadas de pollos distantes de operaciones avícolas comerciales. Presentamos aquí los resultados obtenidos con muestras de aves silvestres en la provincia de Buenos Aires y los comparamos con ambos tipos de pollos de traspatio. En resumen, el objetivo del presente estudio fue determinar la presencia de anticuerpos contra el virus de la anemia infecciosa en aves silvestres de vuelo libre y en más pollos de traspatio no relacionados con el programa Pro Huerta, y compararlos con sueros procedentes de aves de dicho programa.

Material y Métodos

Diseño experimental
Se obtuvieron aleatoriamente muestras de suero de dos tipos de poblaciones de aves de traspatio así como de aves silvestres que llegaron a la Fundación Ecológica Pinamar, o que el autor obtuvo bajo diferentes circunstancias en otros lugares de la provincia de Buenos Aires:

a)      Se obtuvieron 400 muestras de pollos que formaban parte del citado programa social, establecido por el Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA).
b)      Se recolectó un segundo grupo de 350 muestras de suero de pollos de traspatio de lugares tales como General Lamadrid, Laprida, General Madariaga, Paraje Juancho, City Bell, Gonnet y La Plata, en la provincia de Buenos Aires. Todos los pollos donadores de estas muestras se encontraban lejos de operaciones avícolas comerciales.
c)      Se tomó un tercer grupo de 25 muestras de suero de diferentes especies de aves silvestres de varios lugares de la provincia de Buenos Aires.

Las muestras mencionadas en el inciso a) y 300 muestras del inciso b), arriba citadas, se probaron a la dilución 1:100, utilizando el estuche ("kit") comercial de la empresa IDEXX, para el análisis de anticuerpos contra el virus de la anemia infecciosa mediante ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Se realizó una segunda prueba con las muestras del grupo No. 2 mediante la prueba indirecta de anticuerpos fluorescentes (IFA) publicada por McNulty et al. (1989) y Yuasa et al. (1985), usándola básicamente de acuerdo con una descripción previa (Buscaglia y Tohya, 1997). Las muestras de aves silvestres (grupo c) se recolectaron en los distritos de Pinamar, General Lamadrid, City Bell y Gonnet, y se sometieron solamente a la citada prueba de inmunofluorescencia, al igual que 50 muestras del grupo b.

El Dr. Takeshi Mikami (que entonces se encontraba en el Departamento de Microbiología Veterinaria, de la Facultad de Agricultura de la Universidad de Tokio, Tokio, Japón) y el Departamento de Medicina Aviar y Acuática (DAAAM) de la Universidad de Cornell (CU), USA, nos proporcionaros sendas líneas celulares MDCC-MSB-1, que desarrollamos a 39^oC ó 41°C en una atmósfera de 5% de CO₂ en medio RPMI 1640 suplementado con 5% de suero fetal bovino o en medio de LM Hahn con 10% de suero fetal bovino. Las células se subcultivaron a intervalos de 2 a 3 días y se sembraron a razón de 0.5 X 10⁶/ml. Se cultivaron más células MSB-1 como indicamos ya, pero esto último se hizo en el laboratorio del Dr. K. A. Schat, del Departamento de Microbiología e Inmunología, CU durante 2010. Se prepararon frotis con el virus y bajo la técnica que describimos más adelante.

La cepa Cux-1 del virus de la anemia infecciosa (von Bulow et al., 1983) se obtuvo con el permiso del Departamento de Agricultura de Estados Unidos (USDA) a través del DAAAM, procedente dl Sr. R. Wellenstein (SPAFAS. Inc., Norwich, Connecticut, EE.UU.), después de un número desconocido de pasajes en células MSB-1. La misma cepa fue obtenida con el permiso del Ministerio Argentino de Economía, Obras y Servicios Públicos, Secretaría de Agricultura Ganadería y Pesca, Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (SENASA) del DAAAM. La cepa Cux-1 del virus se utilizó para infectar células MSB-1 para realizar la prueba de inmunofluorescencia arriba indicada, según la describen McNulty et al. (1989). Se utilizaron líquidos sobrenadantes del cultivo de células de hibridoma 51.3 (Chandratilleke et al., 1991) para detectar la presencia de antígenos específicos del virus de la anemia infecciosa. Este hibridoma produce anticuerpos monoclonales (MAb) contra la cepa Cux-l del virus de la anemia infecciosa y presenta reacción cruzada con cuando menos otros dos virus de anemia infecciosa del pollo, aislados en la Unión Americana.

Se utilizaron células infectadas con la cepa Cux-1 y células testigos no infectadas MSB-1 como preparaciones positivas al antígeno, para la detección de anticuerpos. Estas se prepararon según lo describieron Lucio et al. (1990) con algunas modificaciones (Buscaglia y Tohya, 1997).

Ninguno de los sueros del segundo ni del tercer grupo resultó positivo a la prueba de ELISA, mientras que el 91% de las aves del primer grupo fue positivo, con títulos elevados. Los sueros del segundo grupo, que resultaron negativos a la prueba de ELISA, también lo fueron ante la prueba de inmunofluorescencia.

Las principales diferencias entre los dos tipos de aves de traspatio muestreadas, fueron sus antecedentes genéticos y las vacunas que recibieron. A diferencia de las parvadas de traspatio del segundo grupo, los pollos del programa Pro Huerta se desarrollaron en el INTA y se vacunaron al día de edad con virus herpes de pavo (HVT).

En Europa, no se ha encontrado evidencia de la presencia de anticuerpos contra el virus de la anemia infecciosa (de Wit et al., 2004; Wunderwald y Hoop, 2002). El primer informe de anticuerpos detectados en aves no comerciales y, especialmente en aves de traspatio en el Continente Americano se publicó en 2006 (Hernandez-Divers et al., 2006) y el segundo informe se presentó en el IX Congreso Argentino Virología (Buscaglia, 2008). Aun cuando Craig et al. (2009) indicaron que no existían más reportes de estudios sobre este virus en Argentina después de 1994, la información mencionada en la introducción muestra lo contrario (Buscaglia 1996; 1999. 2008; Buscaglia et al., 2003).

Tal vez los pollos utilizados como fuente para el programa Pro Huerta hayan sido positivos al virus de la anemia infecciosa o el ambiente en que  se mantuvieron estos animales estaba contaminado. Una tercera causa, aunque poco probable, sería la contaminación con el virus de la anemia infecciosa en la vacuna HVT. Hernandez- Divers et al. (2008) señalaron que los patógenos presentes en los pollos que pastorean libremente crean un riesgo de enfermedad para los pájaros silvestres. El daño potencial para las aves de vuelo libre y para la población de pollos de Argentina puede ser grave, porque el virus de la anemia infecciosa se puede diseminar a otras aves, toda vez que es muy probable que los pollos donados por este programa social sean la fuente de contaminación con el virus. Es probable que el virus de la anemia infecciosa haya sido introducido mediante operaciones avícolas comerciales, pero no podemos ignorar el papel que desempeñan las parvadas Pro Huerta como reservorio de este patógeno. Sin embrago, los estudios preliminares realizados especialmente en aves silvestres de vida libre, dado que también pueden ser reservorios para la transmisión del virus, representando una amenaza para las aves de corral tanto de traspatio como comerciales, no han arrojado resultados positivos. Debe considerarse la necesidad de realizar más estudios, pues el virus de la anemia infecciosa ha sido ya reconocido en aves silvestres en Europa (Campbell, 2001). Las medidas de control y bioseguridad deben ser una alta prioridad entre los avicultores y médicos veterinarios. Es interesante el hecho de que los autores, que caracterizaron recientemente aislamientos del virus de la anemia infecciosa en Argentina (Craig et al., 2009), pertenecen a la misma institución que distribuyó los pollos del programa Pro Huerta entre las familias de escasos recursos. Por esta razón, es muy deseable que participen y apliquen medidas sanitarias para erradicar y eliminar la enfermedad de dichas aves, si es que existe. Ninguna de estas parvadas de pollos se analiza en busca de la presencia de patógenos infecciosos, a excepción de los virus de la Influenza Aviar (IA) y la enfermedad de Newcastle (Buscaglia et al., 2003), por lo que se desconoce su estado de salud. Las parvadas del programa Pro Huerta que ayudaron a entender la ausencia de IA en Argentina (Buscaglia et al., 2007) también pueden ser reservorio de otras enfermedades que podrían causar problemas económicos y ambientales, o sólo para la avicultura comercial sino también para las aves de traspatio y, potencialmente, también para las aves de vuelo libre.

Ninguno de los sueros del segundo y tercer grupos resultó positivo a la prueba de ELISA, mientras que el 91% de las aves del primer grupo fue positivo y con altos títulos. Todas las muestras de suero del segundo grupo resultaron negativas a ELISA e IFA. Hasta el momento, los sueros de las aves silvestres han resultado negativas a la prueba de IFA y lo mismo es válido para los pollos de traspatio no relacionados con el programa Pro Huerta. Los programas sociales como el aquí mencionado deberían evaluar sus consecuencias antes de ser implementados y se deberían revisar en busca de la presencia de agentes patógenos infecciosos.

Deseo dar las gracias al Dr. Karel A. Schat por permitirme usar su laboratorio en la Universidad de Cornell para la preparación de los frotis de las pruebas realizadas con los sueros de aves silvestres y pollos de traspatio.

Buscaglia C. 1996. Un nuevo caso de anemia infecciosa de los pollos. pp 97. In: Libro Resúmenes. V Congreso Argentino de Virología. II Encuentro Virólogos Latinoamericanos. Tandil, Argentina.

Buscaglia C. 1999. Anemia infecciosa de los pollos. pp 27-29. In: Programa de Actividades y Resúmenes. VI Congreso Argentino de Virología. Mesa Redonda X: "Nuevas Prioridades en Sanidad Animal", Buenos Aires, Argentina.

Buscaglia C. 2008. Presencia de anemia infecciosa de los pollos en aves del programa Pro Huerta. IX Congreso Argentino de Virología, Resumen 226-23798. Rev. Argent Microbiol 40 Supl.1: 108-109.

Buscaglia C. 2010. Estudio serológico preliminar de anemia infecciosa de los pollos en aves de traspatio de la provincia de Buenos Aires, Argentina. pp 12. In: III Jornadas y Reunión anual de la Asociación Argentina de Inmunología Veterinaria. 1-2 November. Buenos Aires.

Buscaglia C & Tohya Y. 1997. Serologic survey for antibody against chicken infectious anemia virus in Argentina. pp. 32-33. In: Proceedings of the 46th WPDC, Sacramento, CA, USA.

Buscaglia C, Crosetti CF, Nervi P. 1994. Identification of chicken infectious anaemia, isolation of the virus and reproduction of the disease in Argentina. Avian Pathol. 23:297-304

Buscaglia C, Espinoza C, Terrera MV, De Benedetti R. 2007. Avian Influenza surveillance in backyard poultry in Argentina. Avian Dis. 51:467-469.

Buscaglia C, Prío MV, Villat, M C, Rodríguez V, Risso MA, Albo G. 2003. Serological survey for Newcastle disease in non commercial layers that belong to a social program from Argentina called "Pro-Huerta". pp. 81-82. In: Proceedings of the 51st WPDC, Sacramento, CA, USA.

Campbell G. 2001. Investigation into evidence of exposure to infectious bursal disease virus (IBDV) and chick infectious anaemia virus (CIAV) in wild birds in Ireland. pp 230-233. In: Proceedings of the Second International Symposium on IBD and CIA. Rauischholzhausen, Germany.

Chandratilleke D, O'Connell P, Schat KA. 1991. Identification of chicken anemia virus proteins with monoclonal antibodies. Avian Dis. 35:854-862.

Craig MI, Rimondi A, Delamer M, Sansalone P, Knig GA, Vagnozzi AD, Pereda AJ. 2009. Molecular characterization of chicken infectious anaemia virus circulating in Argentina during 2007. Avian Dis. 53:331-335.

de Wit JJ, van Eck JH, Crooijmans RP, Pijpers A. 2004. A serological survey for pathogens in old fancy chicken breeds in central and eastern part of The Netherlands. Tijdschrift voor Diergeneeskunde 129:324-327.

Hernandez-Divers SM, Villegas P, Prieto F, Unda JC, Stedman N, Ritchie B. 2006. Survey of selected avian pathogens of backyard poultry in northwestern Ecuador. J. of Avian Med. 20:147-158.

Hernandez-Divers SM, Villegas P, Jimenez C, Hernandez-Divers SJ, Garcia M, Riblet SM. 2008. Backyard chicken flocks pose a disease risk for neotropi birds in Costa Rica. Avian Dis. 52:558-566.

Lucio B, Schat KA, Shivaprasad HL. 1990. Identification of the chicken anemia agent, reproduction of the disease, and serological survey in the United States. Avian Dis. 34:146-153.

McNulty MS, Connor TJ, McNeilly F, Spackman D. 1989. Chicken anemia agent in the United States: Isolation of the virus and detection of antibody in broiler breeder flocks. Avian Dis. 33:691-694.

Schat KA & van Santen VL. 2008. Chicken infectious anemia. pp.212-135. In: Saif YM, Fadly AM, Glisson JR, McDougald LR, Nolan LK, Swayne DE (eds). Diseases of Poultry, 12th ed. Blackwell Publishing.

von Bulow. V, Fuchs B, Vielitz E, Landgraf H. 1983. Early mortality syndrome of chickens after dual infection with Marek's disease virus (MDV) and chicken anemia agent (CAA). Zbl. Vet. Med. B 30:742-750.

Wunderwald C & Hoop RK. 2002. Serological monitoring of 40 Swiss fancy breed poultry flocks. Avian Pathol. 31:157-162.

Yuasa N, Taniguchi T, Yoshida I. 1979. Isolation and some characteristics of an agent inducing anemia in chicks. Avian Dis 23:366-385.

Yuasa N, Imai K, Tezuka H. 1985. Survey of antibody against chicken anemia agent (CAA) by an indirect immunofluorescent antibody technique in breeder flocks in Japan. Avian Pathol. 14:521-530.