Aplicación de la serología para el diagnóstico y control de las enfermedades del "Complejo Respiratorio Porcino"

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AUTOR:  Dr. Abel Ciprian Carrasco - Dra. Susana Mendoza Elvira

Modificado Amass, 1998.



Las pruebas serológicas y microbiológicas por lo tanto deben de poseer una buena sensibilidad y especificidad, ya que en las granjas no se observa ningún problema que pueda hacer pensar que la PCP o la neumonía enzootica, o la pasteurelosis pulmonar o enfermedad de Glasser estan presentes. La serología por ejemplo debería de utilizarse por lo tanto, entre otras, en las siguientes situaciones:

1. Confirmación de una infección crónica, previa evaluación de las lesiones pulmonares típicas.

2. Estudio de la cinética de anticuerpos en una granja infectada, para establecer programas de vacunación y/o medicación por vía oral (alimento/agua).

3. Identificación de maternidades infectadas en el caso de la compra de lechones para sistemas de tipo todo dentro, todo afuera. Este punto es importante, para la decisión de muestrear madres, se debe tener en cuenta que hay baja prevalencia, con títulos de anticuerpos bajos y por lo tanto se dificulta la interpretación (aquí la PCP deberá tratarse como una enfermedad de tipo individual, y muestrear a todas las marranas). En el caso de los lechones se deberan de muestrear antes y después del destete a partir de las 8 semanas de edad (dependiendo del sistema de SEW o MEW o convencional).

4. Verificación de la respuesta de anticuerpos frente a una vacunación (se debera de tomar en cuenta que tipo de inmunógeno se esta aplicando para interpretar los resultados serológicos con los diversos antígenos).

5. Estudios serológicos tendientes a un programa de erradicación (Gottschalk, 1998)

XI. SELECCIÓN DE LA MEJOR PRUEBA DIAGNOSTICA
Existen numerosos criterios que determinan cual es la mejor prueba de diagnóstico para una situación dada e incluyen: COSTO, SENSIBILIDAD, ESPECIFICIDAD, RAPIDEZ y DISPONIBILIDAD. Todos esos criterios pueden ser correlacionados a la situación específica. (Zeman, 1997).

Los laboratorios dedicados al servicio de la industria porcina, que cuentan con una buena infraestructura diagnóstica, como son los laboratorios de diagnostico de los Estados Unidos (Zeman, 1997) y probablemente algunos de Salud Animal de México (Valdivia et al, 1997) están enfocados básicamente entre otros, a estos objetivos:

a) A identificar la causa precisa del brote agudo de la enfermedad (desde el diagnóstico de la enfermedad hasta la elaboración de seroperfiles), lo cual permite precisar los métodos de control, para ser rápidamente implementados; permite colectar datos de la enfermedad, para establecer las estrategias de los cambios de manejo, que permitirán prevenir el mismo problema, en el siguiente ciclo de producción

b) A Identificar y eliminar a los animales expuestos conocidos (aplicando la serología ampliamente) para erradicar ciertas enfermedades reguladas por el Gobierno Federal (como es el caso de la Brucelosis)

Las reglas de oro para el Dr. Zeman (1997) y que muchos patólogos y microbiólogos compartimos para el diagnóstico de una enfermedad clínica es:

1º. Identificar las lesiones patológicas que expliquen la aparición de los signos clínicos.

2º. Identificar los patógenos o factores (traumas, toxinas, medio ambiente entre otros) que son conocidos y que están produciendo estas lesiones.

La identificación en ambos casos es crítica, ya que actúan en forma sinérgica para producir un diagnóstico definitivo. La investigación de las enfermedades infecciosas, con solo la observación de las lesiones sin el soporte microbiológico, restringe considerablemente las posibilidades del diagnóstico, así un diagnóstico definitivo por solo las lesiones no puede ser posible.

EJEMPLO: Meningitis purulenta en cerdos de 2 semanas de edad: Meningitis bacteriana. Para el diagnóstico definitivo es necesario realizar cultivos para identificar a: Streptococcus suis, Haemophilus parasuis, Escherichia coli y otros patógenos. Si fuera al contrario, la identificación de estos agentes (aún aplicando las técnicas de PCR) y que no correspondieran a las lesiones patológicas encontradas, es solo la identificación de potenciales patógenos que son ubicuos en la piara y en las instalaciones (Zeman, 1997).

Si la razón de la prueba de diagnóstico es algo (herramienta diagnóstica) para el diagnóstico clínico, muchas veces es muy importante clarificar la meta precisa de la prueba. Si se desea determinar el ambiente limpio de una enfermedad dada, varios factores deben ser considerados en la prueba diagnóstica, como serían: SENSIBILIDAD, ESPECIFICIDAD, NIVEL DE PREVALENCIA ESPERADA y NIVEL DE CONFIANZA SATISFACTORIA.

a) Sensibilidad: Es la habilidad de una prueba para detectar a TODOS los verdaderos positivos.

b) Especificidad: Es la habilidad de una prueba para detectar SOLO a los verdaderos positivos.

Si la prueba es 100% sensible no presentaría falsos negativos (no falla para detectar a los verdaderos positivos); si la prueba es 100% específica no presentaría falsos positivos (no falla para detectar a los verdaderos negativos). Sin embargo, la sensibilidad y la especificidad van de la mano, es decir cuando se afecta uno también el otro. El efecto esperado es cuando aumenta la sensibilidad, puede disminuir la especificidad o bien cuando aumenta la especificidad, puede disminuir la sensibilidad. Si fuera 100% sensible y 100% específica se estaría frente a una prueba perfecta. Desafortunadamente existen pocas pruebas perfectas en el mundo, y se tiene que determinar un cierto nivel de aceptabilidad, como ocurre con el PCR.

El nivel de aceptabilidad esta relacionado a la pregunta especifica que se intenta responder. Si la decisión a tomar es la erradicación de una enfermedad dada, la Normas Oficiales indican que la prueba debe de tener una alta sensibilidad, para identificar a los infectados en forma individual. La prueba mas sensible sería preferida, si la especificidad estuviera insignificantemente comprometida, ya que durante la erradicación un falso positivo raro (verdaderamente negativo) sería mejor para el proceso del mismo, que un falso negativo raro (verdaderamente positivo), ya que estos animales falsos negativos estarían diseminando la enfermedad en la demás población, y afectaría seriamente el proceso de erradicación (Zeman, 1997).

En general, la SENSIBILIDAD de una prueba es de suma importancia, cuando los animales probados y resultaron positivos fueron los que produjeron la enfermedad en la piara sana y limpia, y fueron los que causaron el brote. Así. la ESPECIFICIDAD se convierte de suma importancia, cuando hay interés que un falso positivo no ponga fin a la utilidad de un animal valioso (Zeman, 1997).

El costo de las pruebas de laboratorio en medicina veterinaria (sobretodo en la producción animal: cerdos) es siempre un problema, en algunas ocasiones el costo de $10.00 dólares por prueba, puede ser útil, sin embargo, el costo de $25.00 dólares por prueba, afectaría seriamente la economía de la producción animal. En otras ocasiones el costo de $50.00 dólares por prueba, puede ser de gran utilidad por la prevención de pérdidas económicas.

Ahí es donde se tiene que tener muy claro, que pregunta específica se quiere contestar con la prueba a utilizar y que a la vez sea económica. La popularidad de la prueba afecta también el precio, una demanda de la prueba hace que el laboratorio, se equipe y adquiera los reactivos necesarios para llevarla a cabo y la hace menos cara. De ahí, que los laboratorios estén considerando el costo de las nuevas pruebas y las estén comparando con el costo de las viejas pruebas, y a la vez estén analizando las ventajas y desventajas de las mismas (Valdivia et al., 1997; Zeman, 1997).



XII. TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADAS AL DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO DE LAS ENFERMEDADES RESPIRATORIAS
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica usada para amplificar regiones específicas del ADN. Los principios de esta técnica fueron descritos primeramente en 1971 pero no fue hasta los años 80s que la tecnica fue adaptada y desarrollada completamente. En aquella época esta técnica constituyó una señal muy importante de avance en la biología molecular ya que permitió la gran producción de segmentos específicos del ADN. Esta técnica se basa en el hecho de que ciertas secuencias de una región dada de la molécula del ADN son conocidas (Gingold, 1990).

Por lo tanto PCR se utiliza para amplificar la región entre dos secuencias conocidas. El producto amplificado se puede detectar por diferentes métodos, variando en sensibilidad, exactitud y viabilidad para el diagnostico de laboratorio, como son: el corrimiento en gel de agarosa, Southern Blot, microtítulo en microplacas y la detección directa de tiempo real de los productos en el tubo de PCR visualizado por fluorescencia (Mathew, 1990. Higushi et al., 1993).

La técnica de PCR se puede utilizar para identificar microorganismos causantes de enfermedad y de suma importancia en medicina en donde es necesario un diagnostico rápido. Hoy en dia el PCR no se puede considerar como substituto de la bacteriología clásica. PCR es de inferior sensibilidad a los métodos clásicos cuando las bacterias tienen crecimiento rápido, no obstante tiene muchas ventajas al detectar microorganismos de crecimiento lento o cuando la detección se lleva a cabo en muestras contaminadas. Una de las ventajas más evidentes de la técnica de PCR es la rapidez de los resultados y de que se pueden trabajar muchas muestras. Con la bacteriología tradicional se necesita un mínimo de 2 días para alcanzar una diagnostico rápido. Pero en el caso del PCR, solamente algunas horas son necesarias. Por lo tanto las bacterias de lento crecimiento, o bacterias no cultivables, virus, así como hongos, son los mejores candidatos para ser detectados por PCR (Calsamiglia. 1999; Calsamiglia et al., 1999).

Como ventajas del PCR es la variedad de aplicaciones, y tradicionalmente se ha utilizado como una herramienta de díagnóstico para detectar ciertos microorganismos especificos en muestras clínicas. El PCR también puede utilizarse para realizar estudios epidemiológicos y llevar a cabo una vigilancia epidemiologica en las granjas animales. Otra importante aportacion del PCR es que permite la deteccion de los animales que son portadores de cierta enfermedad (Calsamiglia, 1999; Mendoza et al., 1999) .

Como desventajas del PCR. La detección de falsos negativos: Si los iniciadores no son específicos, si la concentración de los componentes no estan estandarizados y las condiciones de la reacción no estan claras podrían obtenerse resultados falsos negativos. Con respecto a los resultados falsos positivos: Si los iniciadores son homólogos a las secuencias pero no al gen blanco o si los productos y soluciones estan contaminadas con reacciones anteriores, entonces se podrian presentarse falsos positivos (Calsamiglia, 1999). Por lo que el PCR detecta ADN pero no la distingue entre los microorganismos vivos y muertos, ni tampoco detecta sensibilidad a antibióticos.

Muchas técnicas basadas en PCR han sido descritas y se han aplicado en la medicina veterinaría. El diagnostico rutinario para algunos laboratorios de enfocan a los siguientes microorganismos. Pasteurella multocida se detecta toxina positiva DNT (+); Mycoplasma hyopneumoniae (nested-PCR); Streptococcus suis y Haemophilus parasuis (rep-PCR) y PRRSv (Taqman). Éstos son los agentes principalmente implicados en el Complejo de la Enfermedad Respiratoria de los Porcinos (PRDC). Este síndrome es cada vez mas importante la causa de una baja productividad de los cerdos, caracterizado por un crecimiento lento, la baja eficacia alimenticia, anorexia, tos y el disnea, donde están implicados los microorganismos antes de mencionados (Calsamiglia, 1999; Calsamiglia et al., 1999; Dee, 1996; Lichtensteiger et al., 1996).

Dentro de este complejo PRDC se encuentra mas frecuentemente diagnosticado al Mycoplasma hyopneumoniae (Dee, 1996). El estudio de la neumonía causada por Mycoplasma hyopneumoniae ha sido obstaculizada por métodos inadecuados de diagnóstico. Muchas de las pruebas actualmente disponibles son relativamente insensibles o no específicas, demasiado costosas o difícil para realizar un diagnóstico rutinario. El nested-PCR ha permitido un diagnóstico rápido y actualmente en la Universidad de Minnesota se lleva como diagnóstico de rutina. La extracción del DNA se lleva a cabo de los hisopos nasales que llegan de la muestra de los cerdos (Calsamiglia et al., 1999).

Por otro lado las cepas de Pasteurella multocida toxigénicas y no toxigenicas no pueden ser detectadas por la morfología o por las reacciones bioquímicas estándares. La viabilidad de usar PCR para la detección exacta y rápida de Pasteurella multocida toxigénica de hisopos nasales fue investigada pero los resultados no fueron concluyentes (Leinchtensteiger, et al., 1996). Sin embargo otro estudio en la Universidad de Minnesota mostro que de cultivos purificados, se podian detectar cepas de Pasteurella multocida DNT (+), esta técnica fue muy sensible y puede ser comparada con ELISA y con el cultivo celular (Amigot, et.al., 1998).

La infección de los lechones con el virus del Sindrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRSv) se asocia al aumento de las enfermedades respiratorias, con tasa de crecimiento bajo, y elevada mortalidad. El PRRS esta siendo apararentemente controlado con el uso de vacunas de vacunas vivas (MLV) o con manejo (Dee y Philips, 1997). Es importante determinar cuando la infección ocurre en la vida de los cerdos, por lo que que el PCR (Taqman) se ha utilizado como una prueba de díagnóstico para detectar el ácido nucleico viral del PRRS. Esta técnica se puede llevar a cabo en suero, semen, o tejido para detectar el RNA o la ADN viral (Molitor, 1997). En este estudio los resultados de la prueba de PCR indicaron que la serología no solamente puede ser adecuada para definir el status de PRRSv en un hato . Este caso sugiere que las técnicas moleculares puedan ser útiles conjuntamente con la serología. Observaciones de muestras clínicas, y el analisis de los datos de la producción determinaron correctamente el status de PRRSv en el hato y asi definir y establecer claramente el período en la vida del lechón durante la cual son infectados. Una vez que se recoja y se evalúe esta información, las estrategias óptimas de la intervención se pueden determinar para el hato (Dee y Philips, 1997, Zimmerman, et.al., 1998).

En el caso de Streptococcus suis. y de Haemophilus parasuis la técnica de rep-PCR ha mostrado resultados muy útiles para el estudio de la epidemiología en las piaras. La técnica rep-PCR identifica cepas individuales, aún del mismo serotipo (Torremorrell, 1999). Hemos demostrado que la mayoría de los brotes de la enfermedad en granjas son debidos a una sola cepa. También esta técnica nos ha permitido observar la transmisión de estas cepas entre granjas (Mendoza et al., 1999).



XIII. SISTEMA RÁPIDO PARA EL DIAGNOSTICO SEROLOGICO DE App- Hps-Pm-Mh DENOMINADO NEUMOTESTMR . (Marca Registrada UNAM). (Ciprián, et al. 1999)

1. METODOS DE DIAGNOSTICO DE LAS ENFERMEDADES RESPIRATORIAS BACTERIANAS EN MÉXICO.
El diagnóstico definitivo de las enfermedades respiratorias del cerdo, en las que se incluyen; Pleuroneumonía Contagiosa Porcina, PCP; Neumonía Enzoótica, NE; Pasteurelosis Pulmonar, PP y Enfermedad de Glasser, EG, deben ser oportunos y rápidos y es esencial para identificar a Mycoplasma hyopneumoniae y a los diferentes serotipos y tipos prevalentes de Actinobacillus pleuropneumoniae; Pasteurella multocida y Haemophilus parasuis prevalentes en las zahúrdas y en las granjas, así como en las diferentes zonas porcícolas del país, ya que permite utilizar y/ó elaborar los biológicos/reactivos adecuados para el diagnóstico, así como los biológicos para la inmunización de los animales susceptibles. En México, así como en los países latinoamericanos, el diagnóstico de las enfermedades respiratorias bacterinas lo llevan a cabo de la siguiente manera:

a) Observación de los signos clínicos en el cerdo y en los de la zahúrda, este método no es confiable, ya que solo los signos clínicos que se presentan en cursos agudos de las afecciones respiratorias, permiten identificar a la PCP, quizás a la EG, mientras que en los casos crónicos de la misma PCP y EG, además de la NE y PP pasan inadvertidos, y solo se reflejan en los parámetros de la Ganancia Diaria de Peso (GDP) y Conversión Alimenticia (CA).

b) Observación de las lesiones a la necropsia de los animales muertos de los casos agudos o durante la inspección de las canales, en los centros de abasto de los casos crónicos. Para el estudio patológico se requiere de los servicios de un Médico Veterinario especialista en Patología, y aunque algunas lesiones son propias de la PCP se pueden confundir con EG, no así con NE y PP, sin embargo no podemos identificar a los serotipos prevalentes en las zahúrdas de una misma granja.

c) Aislamiento, identificación y tipificación de los microorganismos presentes en los pulmones de los cerdos con problemas agudos o bien crónicos. Este proceso tarda de 48 a 72 horas en el mejor de los casos, como seria con Actinobacillus pleuropneumoniae y Pasteurella multocida; pero es lento en el caso de Haemophilus parasuis, y mas lento para Mycoplasma hyopneumoniae. Para realizar estas técnicas es necesario contar con un laboratorio bien establecido, en donde además de contar con los reactivos, medios de cultivo y antisueros conocidos, se requiere del personal calificado, y en México existen pocos laboratorios que brindan este servicio.

d) El diagnóstico serológico se lleva a cabo en los cerdos vivos de las granjas o en los cerdos en los centros de abasto. El método serológico es uno de los mas adecuados, ya que se puede realizar en los animales vivos con y sin signos clínicos, no requiere del sacrificio de los cerdos, es mas rápido y nos permite hacer perfiles de la enfermedad, identificando el punto de infección en la granja, además permite identificar los serotipos prevalentes. Para el diagnóstico serológico de la PCP, NE, se encuentran algunas pruebas tales como; aglutinación, aglutinación con partículas de latex, aglutinación lenta en tubo; aglutinación lenta en tubo con 2-mercaptoetanol, hemoaglutinación indirecta, fijación de complemento y ELISA entre otras. Pocas de estas pruebas se realizan en México, y las que se utilizan son mas para estudios de investigación que para diagnóstico, debido principalmente a la falta de infraestructura, equipo, y personal capacitado, que solo los laboratorios de las Universidades e Institutos cuentan (Ciprián et al., 1990).

La problemática acerca de la PCP, PP, NE y EG expuesta anteriormente motivo a los autores (Ciprián et al., 1988; Colmenares et al., 1992; Mendoza et al., 1992 y Torres et al., 1992) de este trabajo al desarrollo de un paquete tecnológico diseñado para elaborar a nivel industrial KITS de diagnóstico serológico de la PCP, PP, NE y EG; empleando tecnología sencilla y de bajo costo; paquete tecnológico denominado NEUMOTESTmr App; -Pm; -Mh; -Hps (mr: marca registrada por la UNAM), que permitirá conocer la situación de la granja con respecto a la enfermedad, permitirá conocer mediante los perfiles serológicos los puntos de infección o las ventanas inmunológicas y así poder establecer las medidas de control necesarias.

2. RESUMEN DE LA INVENCION.
El paquete tecnológico NEUMOTESTmr App; -Pm; -Mh; -Hps (mr: marca registrada por la UNAM), consiste en un método rápido que no requiere equipo de laboratorio, se realiza en unos minutos y solo requiere de pocos mililitros de suero del animal a estudiar, por lo que no se necesita de personal calificado. El método rápido es un ensayo de diagnóstico serológico por medio de una prueba de aglutinación directa en placa, que ofrece la única oportunidad de distinguir directamente en la propia granja, si un cerdo ha sido infectado o si el cerdo está sano.

NEUMOTESTmr App; -Pm; -Mh; -Hps (mr: marca registrada por la UNAM), es una prueba de aglutinación en placa destinada a identificar directamente anticuerpos (de la clase IgG de alta afinidad) capsulares de Actinobacillus pleuropneumoniae (serotipos 1 al 12); anticuerpos (clase IgG) LPS de Pasteurella multocida y anticuerpos (clase IgG) capsulares de Haemophilus parasuis y anticuerpos IgG contra Mycoplasma hyopneumoniae presentes en el suero de cerdos de cualquier edad.

El paquete tecnológico consiste en un estuche portatil diseñado para diagnosticar cerdos infectados con Pasteurella multocida (Pasteurelosis Pulmonar, PP); Mycoplasma hyopneumoniae (Neumonía Enzoótica, NE); Actinobacillus pleuropneumoniae (Pleuroneumonía Contagiosa Porcina, PCP) y Haemophilus parasuis (Enfermedad de Glasser, EG). El sistema rápido de diagnóstico serológico se realiza mediante las pruebas de aglutinación o de aglutinación en latex que permite hacerlo en la misma explotación porcina y además de que distingue en los casos de Pasteurella multocida (Pasteurelosis Pulmonar, PP); Actinobacillus pleuropneumoniae (Pleuroneumonía Contagiosa Porcina, PCP) y Haemophilus parasuis (Enfermedad de Glasser, EG), si los cerdos están infectados y en el caso de Mycoplasma hyopneumoniae (Neumonía Enzoótica, NE) determinar los puntos de infección mediante el uso de perfiles serológicos.

El sistema de diagnótico serológico es un estuche que contiene los antígenos, para realización de las pruebas serológicas; estos antígenos varían desde de Pasteurella multocida (tipos capsulares A y D comunes); Actinobacillus pleuropneumoniae (serotipos capsulares: 1, 2, 3, 4,5a, 5b, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12); Haemophilus parasuis (serotipos capsulares: de alta virulencia ++: 1, 5, 10, 12, 13 y 14; o bien serotipos de relativa virulencia +: 2, 4 y 15); hasta el de Mycoplasma hyopneumoniae.

El método para diagnosticar la pasteurelosis pulmonar, la pleuroneumonia, la enfermedad de Glasser o la neumonía enzoótica comprende los pasos de preparar un reactivo de aglutinación o de aglutinación en latex; de estabilizar el reactivo utilizado, a temperatura ambiente en un tiempo corto; de depositar enseguida el suero de muestra en una de las celdas de la placa de prueba; incorporar el reactivo de aglutinación o de aglutinación en latex a la muestra y mezclar enseguida, enseguida se someten los resultados a un método comparativo de interpretación cualitativa, en donde la muestra celda de cerdos infectados presenta un aspecto grumoso, en tanto que la celda de cerdos sanos ó vacunados (siempre y cuando no sean recién vacunados, es decir después de 15 días posvacunación), aparecerán sin grumos.

Otro de los objetivos de la invención es proporcionar un equipo y método en donde los reactivos utilizados permiten que el diagnóstico de las enfermedades respiratorias bacterianas sea de fácil operación y eficiente por no presentar falsos negativos, permitiendo el manejo de los animales sanos de la granja cuando se utiliza como prueba tamiz de monitoreo. Otro mas de los objetivos de la invención es que solo se requiere de una mínima parte del suero para efectuar el diagnóstico y por lo mismo se pueda aplicar a una granja completa, lo que permite evaluar el status inmune de la granja valorando e interpretando los seroperfiles.



XIV. AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen al MVZ David Trujillo por la asesoría técnica en informática.




XV. REFERENCIAS

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AUTOR:  Dr. Abel Ciprian Carrasco - Dra. Susana Mendoza Elvira