Aislamiento y selección de rizobios promisorios para la inoculación de leguminosas forrajeras de interés agrícola y ganadera cultivadas en condiciones de salinidad y acidez en el suelo

Introducción

En Cuba alrededor de un millón de hectáreas están afectadas por salinidad y aproximadamente el 30 % por problemas de acidez. Ambas condiciones limitan el establecimiento de las leguminosas forrajeras las cuales se han empleado con fines agrícolas y ganaderos. El cultivo de estas plantas aumenta la fertilidad del suelo ya que, incrementan el rendimiento de masa seca y el contenido proteico y mineral del forraje. Además son empleadas como alimento animal pues propician un mayor consumo voluntario y digestibilidad por parte de los animales, lo que se traduce en un aumento en el rendimiento de la producción de carne y leche (Menéndez et al., 1993). Por tales razones, el empleo adecuado de leguminosas forrajeras constituye una alternativa viable, especialmente en países en vías de desarrollo.

El aislamiento, caracterización y selección de rizobios; microorganismos diazotróficos que establecen una asociación simbiótica con las plantas leguminosas, constituyen estudios básicos que permiten la elaboración de los biofertilizantes. Estos bioproductos permiten un mayor establecimiento de las leguminosas e incrementan su rendimiento (Nápoles, 2003). La obtención de aislados de rizobios adaptados a condiciones limitantes como la salinidad y la acidez en los suelos, constituye una posibilidad promisoria de explotación en la práctica agrícola y ganadera y una herramienta económicamente viable para la agricultura del país. El objetivo del presente trabajo fue aislar y seleccionar rizobios promisorios para la inoculación de leguminosas forrajeras de interés agrícola y ganadero cultivadas en condiciones de salinidad y acidez en el suelo.

Materiales y Métodos

El estudio se realizó con aislados bacterianos obtenidos de nódulos y suelo rizosférico de las leguminosas forrajeras Desmodium, Alysicarpus y Crotalaria, residentes en suelos salinos de la provincia de Holguín y con un conjunto de aislados provenientes de nódulos de kudzú tropical (diez aislados). Este último grupo de microorganismos pertenecen al cepario del Laboratorio de Bacteriología del Departamento de Fisiología y Bioquímica Vegetal del Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas.

La identificación como rizobios de los aislados bacterianos se basó en una caracterización cultural, una caracterización morfológica mediante tinción de Gram, el resultado a la prueba de la cetolactasa, la determinación de la tasa de crecimiento y la capacidad de estos microorganismos para producir ácido o base y de nodular plantas de Macroptillium atropurpureum (siratro). La caracterización de estos aislados de rizobios incluyó además un ensayo cualitativo de tolerancia a salinidad en medio LMA (Levadura-Manitol-Agar) suplementado con diferentes concentraciones de NaCl (0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 y 3.0 %) y de tolerancia a la acidez (pH de 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5 y 6.8). Con los aislados que tuvieron la capacidad de tolerar menores pH se realizó un ensayo cuantitativo donde se evaluó el efecto del pH en la viabilidad celular.

La selección de los aislados de rizobios promisorios para la elaboración de inoculantes se realizó teniendo en cuenta el número de nódulos en la raíz principal y total, la efectividad de los nódulos en las plantas de siratro y kudzú, así como el efecto de la inoculación de estos microorganismos en variables de crecimiento de estas plantas. Se realizaron además bioensayos de inoculación de los aislados bacterianos en suelos ácidos para determinar su efecto en el rendimiento de kudzú tropical.

Los datos obtenidos del ensayo cuantitativo de tolerancia de los aislados de rizobios a la acidez así como aquellos provenientes de los ensayos de inoculación en plantas de siratro y kudzú fueron sometidos a la prueba de normalidad (test de Bartlett) y homogeneidad de varianza (test de Kormogorov-Smirnov) y se aplicó análisis de varianza de clasificación simple, utilizando el Test de comparación de medias de Tukey para P<0.05 para discriminar diferencias entre las medias (Sigarroa, 1985).

Resultados y Discusión

Según las características culturales descritas para el grupo de los rizobios, establecidas por Wang y Martínez-Romero (2001), se obtuvieron dieciséis aislados bacterianos posibles rizobios, doce de los cuales provinieron de nódulos de Desmodium, Alysicarpus y Crotalaria y el resto se obtuvo a partir del suelo rizosférico de estas leguminosas.

La tinción de Gram permitió observar que quince de estos aislados presentaron características morfológicas similares a las descritas para el grupo de los rizobios según lo informado por Wang y Martínez-Romero (2001) ya que, se observaron como cocobacilos, bacilos finos ó redondeados no esporulados y Gram negativos. Tres aislados resultaron positivos a la cetolactasa los cuales fueron retirados de los estudios posteriores. Doce aislados obtenidos de la rizosfera de estas leguminosas crecieron a las 48 h en el medio LMA, mientras que el resto se observaron al quinto día de cultivo. Del total de aislados obtenidos de la rizosfera de estas plantas nueve produjeron ácido y tres produjeron base.

Se caracterizaron además 10 aislados provenientes de nódulos de kudzú tropical cultivadas en condiciones de acidez en el suelo. Todos estos aislados presentaron características culturales y morfológicas similares a las descritas por Wang y Martínez-Romero (2001) para el grupo de los rizobios. Estos microorganismos resultaron negativos a la cetolactasa, se observaron al quinto día de cultivo en el medio de cultivo y produjeron base.

La realización de bioensayos de inoculación en plantas de siratro (para los aislados provenientes de Desmodium, Alysicarpus y Crotalaria) y plantas de kudzú (para los aislados provenientes de nódulos de kudzú) permitió confirmar la pertenencia de 21 aislados bacterianos al grupo de los rizobios ya que, produjeron nódulos efectivos en las raíces de estas plantas. Del total de aislados caracterizados, ocho presentan características fenotípicas similares a las observados en la familia Rhizobiaseae mientras que los trece restantes presentaron características semejantes a las descritas para el género Bradyrhizobium (Berrada y Fikri-Benbrahim, 2014).

Los ensayos de inoculación in vitro permitieron observar un efecto positivo en las variables de nodulación y crecimiento de las plantas de siratro y kudzú tropical (tabla 1). El aislado P8 I (I) produjo los mayores incrementos tanto en las variables de nodulación como en la masa seca aérea de las plantas de siratro. No se observaron diferencias significativas entre este aislado y P8 (II) en el número y la efectividad de los nódulos en la raíz primaria ni en el número de nódulos totales efectivos, aunque estas diferencias se hicieron apreciables en el número total de nódulos y en la masa seca aérea de las plantas. El aislado P5I se destacó en el número de nódulos en la raíz primaria y en su efectividad así como en la masa seca aérea de las plantas de siratro.

El aislado 2-4 produjo los mayores incrementos en todas las variables analizadas sobre todo en la masa seca de los nódulos totales donde se observaron diferencias significativas con el resto de los tratamientos realizados. Al emplear 1-1, 2-4, 2-5 y K2 se produjo un mayor número de nódulos totales y totales efectivos con respecto a los tratamientos en los que se emplearon 12-4, 12-5 y K14. A pesar de que el aislado K2 fue uno de los que produjo mayor número de nódulos totales, su masa seca fue inferior a los tratamientos en los que se utilizaron 2-4, 2-5 y K1, aislados con capacidad para nodular el cultivo de manera similar. Las plantas inoculadas con los aislados 2-4 y 2-5 tuvieron mayor masa seca aérea, y se correspondieron con aquellas que presentaron mayor número de nódulos totales, nódulos totales efectivos y masa seca de nódulos totales. Por consiguiente las plantas de kudzú con mayor cantidad de nódulos efectivos tienden a desarrollar mayor biomasa vegetal.

Se determinó la tolerancia a diferentes concentraciones de NaCl en el medio a los aislados P5 I, P8 I (1), P8 II, microorganismos que produjeron los mejores resultados en la nodulación y el crecimiento de las plantas de siratro. El aislado P5I, tuvo la capacidad de crecer en medio con 2 % de NaCl, mayor concentración salina ensayada (tabla 2). Una de las estrategias empleadas por los microorganismos sometidos a estrés salino para mantener su viabilidad en el medio es la llamada «estrategia del soluto compatible» donde mantienen el balance osmótico mediante pequeñas moléculas sintetizadas por ellos o tomadas del medio con el objetivo de permitir el funcionamiento adecuado de las enzimas (González-Hernández et al., 2002). Este pudiera ser el mecanismo empleado por el aislado P5I para tolerar las relativamente altas concentraciones de NaCl presentes en el medio.

Aislamiento y selección de rizobios promisorios para la inoculación de leguminosas forrajeras de interés agrícola y ganadera cultivadas en condiciones de salinidad y acidez en el suelo - Image 1

Leyenda: NNrp: Número de nódulos en la raíz primaria; NNerp: Número de nódulos efectivos en la raíz primaria; NNte: Número de nódulos totales efectivos; MSNt: Masa seca de nódulos totales. Letras comunes por columna no difieren significativamente (Tukey, P<0.05)

El crecimiento de los aislados procedentes de kudzú en medios con diferentes niveles de acidez permitió observar que 1-2, 2-4, K1 y K2; tuvieron la capacidad de crecer en medios con pH desde 3.5 hasta 6.8. Por ello se comparó el número de células viables en cultivos de estos aislados a pH= 6.8 (control) y a pH= 4.5, nivel de acidez presente en los suelos de donde fueron aislados estos microorganismos. En los aislados 2-4 y K2 no se observaron diferencias significativas en cuanto al número de ufc.mL-1 en los medios con pH 4.5 y 6.8. Se observó además un mayor número de viables en el aislado 2-4 cuando este fue cultivado en medios con pH= 4.5 que cuando se creció a pH= 6.8 (tabla 2). El comportamiento observado en estos tres aislados pudiera deberse a la presencia en estos microorganismos de mecanismos de tolerancia a condiciones de acidez en el suelo lo cual le haya permitido establecerse en la rizosfera de las plantas de kudzú. La excreción de bases, la exclusión de protones y la síntesis de proteínas de shock ácido, son algunos de estos mecanismos (Graham et al., 1994).

La inoculación del aislado K2 sobre semillas de kudzú tropical por el método de recubrimiento de la semilla, produjo un incremento en los rendimientos de masa seca y semillas de hasta un 75 %, de modo similar a los alcanzados con aplicaciones de 100 kg de N.ha-1. Además, produjo incrementos en la producción de masa seca de un 47 a un 75 % con relación al tratamiento sin fertilizante nitrogenado ni inoculación.

Los aislados P8 I y P8, provenientes de nódulos de Crotalaria; P5I de nódulos de Alysicarpus; ambas leguminosas establecidas en suelos salinos, además de los aislados 1-2, 2-4, K1 y K2 de nódulos de kudzú tropical, cultivada en suelos ácidos; constituyen microorganismos que establecen una asociación simbiótica efectiva con siratro y kudzu, respectivamente. Estos microorganismos constituyen aislados promisorios que por su capacidad de adaptación a las condiciones de salinidad y acidez en los suelos, pudieran mejorar el establecimiento de estas leguminosas e incrementar su crecimiento y rendimiento. Esto no solamente permitiría su empleo como cultivos de cobertura en plantaciones permanentes, sino también como alimento animal.

Referencias

Berrada, H. & Fikri-Benbrahim, K. 2014. Taxonomy of the Rhizobia: Current Perspectives. British Microbiology Research Journal 4(6), 616–639.
González-Hernández, J. C. & Peña, A. 2002. Estrategias de adaptación de microorganismos halófilos y Debaryomyces hansenii (Levadura halófila). Rev. Latinoam. Microbiol. vol. 44, no.3, p. 137-156.
Graham, P. H., Draeger, K., Ferrey, M. L., Conroy, M. J., Hammer, B. E., Martinez, E., Naarons, S. R. & Quinto, C. 1994. Acid pH tolerance in strains of Rhizobium and Bradyrhizobium, and initial studies on the basis for acid tolerance of Rhizobium tropici UMR1899. Can J. Microbiol. 40: 198–207.
Menéndez, J.; Vega, Susana & Tang, M. 1993. Comportamiento de leguminosas tropicales asociadas con Andropogon gayanus. Pastos y Forrajes. 16:13.
Nápoles, M. C. 2003. Inducción de la nodulación en soya (Glycine max (L.) Merrill) por Bradyrhizobium sp. influencia del medio de cultivo. Tesis doctoral. Facultad de Biología, Universidad de la Habana. Ciudad de la Habana, Cuba.
Sigarroa, A. 1985. Biometría y Diseño Experimental. Primera parte. Editorial Pueblo y Educación. Ciudad de La Habana, Cuba, p. 319-328.
Wang, E. T. & Martínez-Romero, J. 2001. Taxonomía del Rhizobium. En: Martínez Romero, E. y Martínez-Romero, J. C. (Eds.) Microbios. Centro de Investigaciones sobre Fijación de Nitrógeno. Universidad Nacional Autónoma de México, México. 264 p.