Los Resultados obtenidos en experimentos controlados, demuestran que el plasma porcino atomizado no es infectivo para el virus de la diarrea epidémica porcina (PEDv)

El virus que causa la diarrea epidémica porcina (porcine epidemic diarrhea virus, PEDv) es un patógeno difícil de controlar que causa una gran mortalidad en cerdos jóvenes provocando grandes pérdidas económicas en la industria porcina. Este virus se caracteriza por propagarse muy fácil y rápidamente en las explotaciones porcinas. La principal ruta de infección es el contacto directo con cerdos infectados o con las heces procedentes de animales infectados. Hasta el momento no se han identificado de forma clara otros vectores de transmisión o causas de infección. No obstante se ha especulado mucho sobre el posible papel del pienso y algunos ingredientes del mismo en la trasmisión de la enfermedad. Ciertas conclusiones, tomadas únicamente en base a datos epidemiológicos, han sido publicadas y aceptadas como hechos probados a pesar de no estar fundamentadas en datos experimentales objetivos que demuestren su validez. Este hecho ha generado una extensa discusión, tanto en congresos y seminarios del sector, como en diversas publicaciones y comunicados de prensa, sobre el papel de los piensos e ingredientes de los mismos en la trasmisión de la enfermedad.

Tras las investigaciones realizadas sobre el primer caso de PEDv en Ontario (Canada) se concluyó que el pienso utilizado en la explotación, que contenía plasma porcino atomizado, era la fuente del virus. La agencia canadiense de inspección alimentaria (CFIA) declaró que se había detectado la presencia de virus infectivo en las muestras de plasma porcino pero no en el pienso que contenía este ingrediente. A pesar de estos resultados contradictorios, muchos han concluido que el plasma porcino atomizado contenía virus infectivo y que por tanto, este ingrediente fue el responsable de la transmisión del virus. En base a esta conclusión algunos veterinarios han recomendado no utilizar plasma porcino atomizado, y en algunos casos otros ingredientes de origen porcino, en piensos para cerdos a pesar de todos los beneficios sustentados y demostrados científicamente durante años derivados de la inclusión del plasma porcino atomizado en la alimentación porcina.

Esta publicación pretende por tanto revisar los resultados obtenidos en diferentes experimentos controlados realizados con el objetivo de comprobar la hipótesis de si realmente el plasma porcino atomizado contiene virus PED infectivo. 

Se inoculó plasma bovino líquido con el virus PED (cepa CV777) hasta una concentración final TCID50 (dosis infectiva media para tejidos en cultivo) de 104,5 por ml de plasma líquido. Tres alícuotas diferentes del plasma líquido inoculado con PEDv fueron secadas por atomización utilizando un equipo de laboratorio (Büchi 190 Mini Spray Dryer) a una temperatura de entrada de 200°C (392°F). Con el objeto de emular las condiciones reales de producción del plasma atomizado comercial, el producto fue procesado para alcanzar 70 o 80ºC a través de su sustancia. La temperatura normal de salida del producto comercial en las plantas de producción es de 80ºC a través de su sustancia, no obstante se obtuvieron y testaron muestras obtenidas a una temperatura inferior (70ºC) para determinar si el virus puede permanecer activo a esa temperatura. Tanto las muestras líquidas como las atomizadas fueron analizadas para la infectividad del virus PED en células VERO en monocapa utilizando el procedimiento de micro-titulación con tres pases consecutivos en cultivos celulares nuevos de células VERO. La cepa del virus PED CV777 se utilizó en este estudio debido a que es bien conocido que esta cepa multiplica bien en células VERO y puede alcanzar una concentración de virus elevada para poder determinar y comprobar que la atomización inactiva una cantidad elevada del virus de la PED. 

Resultados:

Estos resultados indicant que el virus de la PED es inactivado en condiciones simuladas de atomización comercial a temperaturas incluso inferiores a los que la industria utiliza para la producción comercial. La infectividad mediante el virus PED en las muestras de campo investigadas por la CFIA fueron probablemente como resultado de una contaminación post-procesamiento.

 

Como el plasma investigado por la CFIA se produjo en Estados Unidos, la CFIA solicitó una investigación a la FDA que por su parte inspeccionó la planta de producción americana, revisó todos los registros de producción incluyendo los del producto investigado por la CFIA y recogió muestras del lote específico de plasma atomizado. Tras revisar todos los registros se comprobó que el lote investigado había sido producido bajo las condiciones normales de producción.

De forma independiente, las muestras recogidas por la FDA y las equivalentes recogidas por NASDBPP fueron enviadas para realizar análisis posteriores incluyendo bioensayos con cerdos. Se utilizaron muestras del lote investigado por la CFIA y muestras de dos lotes de producción elegidos al azar. 

Los resultados del bioensayo realizado por la FDA revelados recientemente muestran:

 

Los resultados de los bioensayos realizados por la Universidad de Minnesota a petición de la NASDBPP mostraron: 

Los resultados obtenidos en ambos bioensayos (FDA y NASDBPP) muestran que las muestras procedentes del lote de plasma porcino atomizado investigado por la CFIA no son infectivas, sin embargo la CFIA informó que las muestras de plasma recogidas contenían virus PED infectivo. Es importante tener en cuenta que las muestras recogidas e investigadas por la CFIA fueron tomadas después de que el producto fuese recogido por el cliente y entregado y almacenado en la empresa productora de pienso donde se mantuvo hasta la fabricación del mismo.

 

En el ensayo se utilizaron cuarenta y ocho lechones destetados a los 21 días de edad distribuidos al azar en dos grupos o tratamientos con 6 corrales por tratamiento (Trt) y 4 lechones por corral. Los dos grupos experimentales fueron:

La composición de ambas dietas fue similar a la estándar comercial para lechones destetados. El plasma porcino atomizado se incluyó al 5% reemplazando concentrado de soja en condiciones iso-lisina. El lote de plasma porcino atomizado utilizado fue el que presentaba menor valor de Ct de todos los producidos a lo largo del año 2014. Las dietas utilizadas se administraron en forma de harina durante 14 días post-destete, tras ese tiempo todos los animales recibieron una misma dieta control durante 7 días adicionales. La instalación en la que se realizó el experimento, había alojado anteriormente animales negativos para el virus de la PED.

Durante todo el ensayo se controló diariamente la aparición de síntomas clínicos relacionados con enfermedad respiratoria y entérica, así como la aparición y severidad de diarrea en todos los corrales y animales del ensayo. Se realizaron hisopos rectales de cada uno de los animales en los días 0, 3, 7, 14 y 21 para análisis de PEDv por PCR. Los animales fueron sacrificados y necropsiados el día 21 para control macroscópico de los principales órganos y tejidos con el fin de detectar cualquier anomalía. Así mismo, se recogieron muestras de contenido intestinal para análisis de PCR, muestras de tejido intestinal para IHC y muestras de sangre para analizar la presencia de anticuerpos contra el virus de la PED.

Los resultados demuestran que tras alimentar lechones con una dieta conteniendo un 5% de plasma porcino atomizado comercial PCR positivo para el virus PED no existe ninguna evidencia de infectividad a lo largo de los 21 días post-destete.

 

En este experimento una cantidad conocida de plasma porcino atomizado fue inoculado con el virus PED hasta una concentración final TICD50 de 103 por gramo de producto y mantenido a temperatura ambiente (20-22ºC) durante una semana. Las infectividad de las muestras iniciales y finales se testaron en células VERO en cultivo tal y como se ha descrito en estudios anteriores. A los 7 días de almacenamiento no se detectó virus PED infectivo en el plasma atomizado previamente inoculado. 

En base a los resultados obtenidos en el estudio anterior, se inició un nuevo experimento diseñado para comprobar la incidencia del tiempo de almacenamiento del plasma atomizado a diferentes temperaturas sobre la supervivencia del virus PED. En este experimento se contaminó externamente con el virus PED plasma bovino atomizado que fue almacenado a 4, 12 y 21ºC. El aislamiento del virus, como se indica en experimentos anteriores, se realizó en los días 0, 7, 14 y 21 tras inoculación del virus (en total 12 muestras analizadas).

Cuando se evalúa toda esta información resulta lógico pensar que si el lote de plasma porcino investigado por la CFIA presentaba infectividad, la contaminación con el virus PED se produjo externamente en algún momento entre finales de diciembre del 2013 e inicios de enero del 2014. 

Figura 1. Evolución de la temperatura de un big-bag de una tonelada de plasma porcino atomizado almacenado en un almacén a condiciones ambientales en Iowa durante Febrero de 2014.

APC Inc posee una planta de producción en el sur de Brasil dedicada exclusivamente al tratamiento de sangre porcina. Entre finales de diciembre de 2013 e inicios de enero del 2014 se tomaron varios lotes de sangre porcina atomizada para analizar la presencia de material genético del virus PED mediante PCR. Todas las muestras resultaron negativas, lo que confirma que el virus no está presente en Brasil tal y como ya habían comunicado los veterinarios de ese país. Durante el año 2013 se exportaron desde US a Brasil cantidades suficientes de plasma porcino atomizado para alimentar entre 2,5 y 3,5 millones de cerdos. A pesar de la gran cantidad de plasma porcino atomizado procedente de US (PCR positivo para el PEDv) que se utilizó como ingrediente en piensos de cerdo en Brasil, nunca se ha diagnosticado la diarrea epidémica porcina causada por PEDv en ese país. 

Entre abril y diciembre de 2013 suficiente cantidad de plasma porcino atomizado para alimentar ente 4,5 y 5 millones de cerdo fue exportado desde US al oeste de Canadá. El plasma procedente de plantas norteamericanas era PCR positivo para PEDv. Sin embargo, durante ese periodo no se detectaron casos de diarrea epidémica porcina en el oeste de Canadá. De hecho la cabaña porcina del oeste de Canadá permaneció PEDv negativa durante marzo de 2014 con la excepción de un caso detectado en febrero del 2014 no relacionado con el consumo de pienso. A finales de abril se localizaron 3 muestras ambientales que fueron positivas a la presencia del virus en dos zonas de alta densidad de tránsito en la región de Manitoba. Según el director general de la Oficina Veterinaria Canadiense los casos de contaminación ambiental en Manitoba no se han correlacionado con granjas de las zonas.

En síntesis, tanto los resultados obtenidos en experimentos controlados, como el hecho de que entre 2,5 y 3,5 millones de cerdos en Brasil y de 4,5 a 5,0 millones en el Oeste de Canadá hayan sido alimentados con piensos conteniendo plasma porcino atomizado PCR positivo para PEDv procedente de US, apoyan la conclusión de que el plasma porcino atomizado ni contiene virus PED infectivo ni transmita la enfermedad. No obstante, todos estos datos no excluyen la posibilidad de que el plasma porcino atomizado, o cualquier pienso que lo contenga, puedan resultar contaminado externamente con virus infectivo. De hecho, todos estos datos apoyan la hipótesis de que el plasma porcino atomizado analizado por la CFIA fue contaminado con virus infectivo en algún punto de la cadena de distribución del producto tras su comercialización y cercano al momento de administración a los animales.

Todos los datos indicados anteriormente, así como los publicados en el pasado, demuestran que la técnica de PCR únicamente indica presencia del genoma del virus en el plasma porcino atomizado, pero no distingue entre formas infecciosas y no infecciosas del virus. Un resultado PCR positivo por sí solo no indica que el material analizado contenga formas infectivas del virus. Resulta absolutamente necesario realizar experimentos controlados, como los recogidos en este documento, para realmente comprobar si un ingrediente como el plasma porcino atomizado es seguro en términos de PEDv.