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Estudio de la frecuencia del virus de la influenza humana AH1N1 en poblaciones de cerdos del estado de Jalisco a través de la técnica PCR tiempo real

Publicado: 1 de junio de 2016
Por: David Sanchez Chipres, M. A. Ayala-Valdovinos, T. Duifhuis –Rivera, J. Galindo-García y L. A. Guerrero-Quiroz. Departamento de Producción Animal. Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias (CUCBA). Universidad de Guadalajara, Jalisco, México
Resumen

El objetivo de este estudio fue estimar la frecuencia del virus de la influenza humana AH1N1 en poblaciones porcícolas del estado de Jalisco a través de la implementación de la técnica de RT-PCR tiempo real, para este propósito fueron muestreados 300 cerdos de nueve municipios del Estado. Las muestras de sangre de los cerdos se obtuvieron para primeramente detectar (RT-PCT) el género del virus de la influenza A, encontrándose 33 animales positivos en esta prueba (11%) posteriormente estas muestras fueron también analizadas (RT-PCT) para el subtipo AH1N1, resultando todas negativas.

Palabras clave: Influenza humana, RT-PCR Tiempo real, cerdos

Introducción
La influenza es una enfermedad viral, que a lo largo de la historia ha tenido varias denominaciones, la más famosa es la de “Gripe”. Se puede presentar en forma epidémica estacional o pandémica, motivo por el cual ha sido ampliamente descrito a través de los años, aislado por primera vez en 1933 (Higuchi y col. 1993) y registrándose brotes epidémicos cada uno a tres años, por lo menos desde hace 400 años. Su impacto en la actualidad está dado por el aumento en la tasa de mortalidad asociada a enfermedades respiratorias crónicas (Osores y col. 2005, Sandrock y Kelly,. 2007). Esta enfermedad febril aguda, representa un ejemplo clásico de las enfermedades emergentes y re-emergentes, con una historia bien documentada a lo largo de sus pandemias más importantes. El origen del virus influenza humana de la pandemia de 1918 es un misterio. En el resto de las pandemias todos los virus influenza “A” han sido descendientes de los virus aviarios prevalentes (Stanford, 1997).
El cerdo contiene receptores para los virus de la influenza aviar y humana, es capaz de replicar todos los virus de origen aviar. La transmisión del virus de la influenza aviar a cerdos en ausencia de la enfermedad y la diseminación de los virus humanos “H1N1” y “H3N2” en cerdos, apoyan la teoría de la “recombinación genética con las de otras especies” aunque a la fecha no hay evidencias que impliquen al cerdo en la generación de pandemias por el virus de la influenza.
La influenza es capaz de ocasionar la muerte por diferentes mecanismos, como la neumonía viral primaria, neumonía bacteriana secundaria en pulmones previamente afectados por el virus y mediante un síndrome similar al de la dificultad respiratoria aguda posiblemente asociado con una respuesta inmune exagerada. Además puede haber exacerbación de enfermedades crónicas, como la diabetes mellitus, enfermedades renales e insuficiencia cardiaca congestiva. (Murphy y col. 1982, WHO 2001, Samson y col. 2006).
En últimos años la influenza ha tomado importancia en el orden epidemiológico mundial, como un factor de atención dentro de la salud humana y animal, debido a los diversos brotes en diferentes países en la última década. Sin embargo, en México país donde oficialmente1 inicia la última pandemia de influenza, no existe suficiente información que aborde la situación actual de dicho virus dentro de las poblaciones de cerdos en Jalisco, situación de que debe ser tomada en cuenta por ser el estado con mayor población de cerdos del país.
Es de interés estudiar la presencia del virus de la influenza en poblaciones de cerdos del estado Jalisco, por el surgimiento de posibles nuevas variantes que afecten a esta especie tanto en su morbilidad como mortalidad. Asimismo, es importante contar con una metodología de diagnóstico altamente sensible y específica avalada por la Organización Mundial Salud (OMS) que permita conocer la frecuencia del virus de influenza AH1N1 (OMS, 2009).
 
Materiales y Métodos
Muestreo de los animales: De acuerdo con la población de cerdos del estado de Jalisco se determino la asignación proporcional de la muestra con la siguiente fórmula: 
Estudio de la frecuencia del virus de la influenza humana AH1N1 en poblaciones de cerdos del estado de Jalisco a través de la técnica PCR tiempo real - Image 1
Para este estudio se muestrearon 300 animales de once explotaciones en diez diferentes municipios.
Para la toma de la muestra de los animales se extrajeron 5 ml de sangre completa de la vena cava craneal en tubo KENDALL® estéril con EDTA como anticoagulante. En cerdos de ambos sexos, edades y etapas distintas (destete, desarrollo, finalización, vientres y sementales). Las muestras se almacenaron a 4ºC previa extracción de ARN. 

Extracción de ARN
La extracción de ARN fue efectuada por medio del Kit de ZYMO RESEARCH: “ZR Viral
RNA Kit

Transcriptasa inversa
Antes de poder realizar la prueba de PCR-Tiempo Real es necesario convertir las molecular de ARN a ADN complementario, en este estudio se realizó por medio del kit “SuperScrip® VILO” de invitrogen.
La reacción de la transcriptasa inversa se realizó en un termociclador TECHNE-5000. RT-PCR Tiempo Real
Para la realización de la prueba se utilizó un kit de la empresa Primerdesign® con oligonucleótidos iniciadores para:
o El género de virus influenza A, con FAM como fluoroforo marcador.
o Subtipo AH1N1, con FAM como fluoroforo marcador.
o Control positivo interno de RNA endógeno (IPC), con VIC como fluoroforo marcador.
La reacción RT-PCR Tiempo Real se realizó en un termociclador StepOnePlus™ de Applied Biosystems
 
Resultados y Discusión
Se realizaron las pruebas de RT-PCR tiempo real para las 300 muestras procesadas, con la sonda para identificar el género de influenza A con FAM como fluoroforo marcador Figura 1
Estudio de la frecuencia del virus de la influenza humana AH1N1 en poblaciones de cerdos del estado de Jalisco a través de la técnica PCR tiempo real - Image 2
Figura 1. Prueba de RT-PCR tiempo real realizada con muestras tomadas del municipio de Zapotlanejo, Jalisco. Ventana de resultados del experimento presencia/ausencia, StepOne™ Software ver. 2.1

De las 300 muestras procesadas dentro del estudio 33 muestras fueron positivas al género de influenza A
Las 33 muestras positivas al género de Influenza A fueron nuevamente analizadas, ahora con la sonda del para el subtipo AH1N1, con FAM como fluoroforo marcador, de las cuales ninguna resultó ser positiva al subtipo AH1N1 (Figura 2).
Estudio de la frecuencia del virus de la influenza humana AH1N1 en poblaciones de cerdos del estado de Jalisco a través de la técnica PCR tiempo real - Image 3
Figura 2. Prueba de RT-PCR tiempo real con sondas para el subtipo AH1N1, mostrándose todas las muestras negativas, la única celda con presencia es el control positivo. Ventana de resultados del experimento presencia/ausencia, StepOne™ Software ver. 2.1.
Estudio de la frecuencia del virus de la influenza humana AH1N1 en poblaciones de cerdos del estado de Jalisco a través de la técnica PCR tiempo real - Image 4
De las 300 muestras procesadas durante este estudio, sólo 33 fueron positivas a la sonda del kit para la detección del género “A” de la influenza y ninguna fue positiva para el subtipo AH1N1. Descubriéndose la ausencia del subtipo AH1N1 dentro de las muestras de las poblaciones estudiadas.
Investigaciones anteriores aún con muestreos más grandes han encontrado frecuencias bajas de dicho subtipo, en un estudio de perfil serológico ELISA para el virus de influenza porcina realizado en Yucatán (Álvarez y col., 2004), se analizaron 1000 muestras de cerdos de 25 explotaciones de ciclo completo, se encontró una frecuencia positiva de 56% a influenza, pero sólo un 8.3% de estos sueros fueron positivos al virus AH1N1. Una situación semejante puede encontrarse en una investigación efectuada a principios del año 2011 en Inglaterra sobre la prevalencia del virus de la influenza en cerdos, donde se analizaron un total de 2,780 muestras de sueros procedentes de 146 granjas, que sometieron a pruebas de inhibición de la hemaglutinación. De las cuales; únicamente 119 muestras (4.3%) presentaron anticuerpos contra la influenza AH1N1 (Mastin y col. 2011). Asimismo, en un ensayo realizado en el Centro Nacional Enfermedades Extranjeras en Animales de Winnipeg Canadá en el año 2010, obtuvieron una muestra positiva y dos sospechosas a influenza, de un muestreo 24 cerdos con un historial clínico de enfermedades respiratorias, utilizando una prueba de RT-PCR tiempo real para el gen M1 de la influenza (Weingart y col., 2010).
 
Conclusiones
Los resultados del presente trabajo muestran la existencia del género “A” de la influenza en las poblaciones estudiadas, también de forma contrastante revela una frecuencia nula del subtipo de influenza AH1N1, lo que indica que este subtipo del virus de la influenza porcina no cuenta con una presencia de consideración dentro de dichas explotaciones.
 
Referencias
  • Álvarez F. M., Rodríguez B. J. C., Ciprián C. A., Rodriguez G. L., Ayora T. G., Segura C. J. C. 2004. Perfil serológico del virus de la influenza porcina, Mycoplasma hyopneumoniae y Actinobacillus pleuropneumoniae, en granjas de Yucatán, México. Veterinaria México 35 (4): 295-305.
  • Boivin, G.; Hardy, I. & Kress, A. Evaluation of a rapid optical immunoassay for influenza viruses (FLU OIA test) in comparison with cell culture and reverse transcription- PCR. Journal of Clinical Microbiology, 2001; 39, 730 - 732.
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  • Kida, H.; Ito, T.; Yasuda, J.; Shimizu, Y.; Itakura, C.; Shortridge, K.; Kawaoka, Y. & Webster, R. Potential for transmission of avian influenza viruses to pigs. Journal of General Virology, 1994; 75, 2183-2188.
  • Mastin A., Alarcon P., Pfeiffer D., Wood J.,Williamson S., Brown I, Consortium C, Wieland B., Prevalence and risk factors for swine influenza virus infection in the English pig population. PLoS Curr. 2011 February 11; 3: RRN1209. PMCID: PMC3032880
  • Navas T., Calatroni M.I. Estado actual de la vacunación en adulto y grupos especiales. Méd Caracas. 2008; 116:524-530.
  • Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE). Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals (mammals, birds and bees). Fifth edition. USA, 2004; 1119. 
  • Oropesa S. Orthomixovirus. En: Llop A., Valdes D. M., Zuazo J. Primera Edición. Microbiología y Parasitología Médicas. Editorial Ciencias Médicas.Cuba.
  • Osores-P. F., Cabezas-S. C., Gómez-Benavides J., Maguiña Vargas C. Influenzas humana y aviar: amenaza de una pandemia humana. Editorial ciencias Médicas. Cuba , 2005. 
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Autores:
David Román Sánchez Chipres
Universidad de Guadalajara
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Jorge Galindo García
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