Utilización de fluorocromos para la evaluación de las membranas plasmática y acrosomal en espermatozoides porcinos

La integridad de la membrana plasmática (IMP) de los espermatozoides (Z), es uno de los parámetros más estudiados por su rol como límite celular y principal responsable de las interacciones intercelulares. Su evaluación rutinaria se lleva a cabo con la tinción vital de Eosina-Nigrosina (E/N) por medio de microscopía de campo claro. La membrana acrosomal (IMA) es fundamental en la penetración de la zona pelúcida del ovocito; de rutina se evalúa utilizando microscopía de contraste de fase.

En los últimos años se ha incrementado el uso de fluorocromos para realizar dichas evaluaciones. La aglutinina del Pisum Sativum (PSA), marcada con Isotiocianato de Fluoresceína (FITC), es una lectina que se une a la matriz glicoproteica acrosomal (Silva & col, 2006), permitiendo detectar la presencia de daño en la misma. Aquellos Z dañados exhiben fluorescencia verde-amarillenta sobre la porción rostral de la cabeza y en el segmento ecuatorial (Nolan & col, 1992).

El Ioduro de Propidio (PI) es un fluorocromo que ingresa a las células espermáticas que presentan su membrana plasmática dañada emitiendo fluorescencia color rojo (de Arruda & col, 2007). El Hoechst 33342 (H) es un fluorocromo intercalante del ADN que permite visualizar Z vivos , emitiendo fluorescencia color azul (Mouiño Otero & col, 2005) Los objetivos de este trabajo fueron validar para nuestro laboratorio el uso del PSA–FITC como marcador del estado acrosomal de los Z porcinos comparándolo con la evaluación mediante contraste de fase y establecer un protocolo que permita la evaluación simultánea de la IMP e IMA mediante el uso de fluorocromos.

 

Se evaluaron 36 muestras de semen porcino provenientes de cuatro verracos, las mismas se obtuvieron por la técnica de mano enguantada. Se evaluó en todas las muestras movilidad total y progresiva (contraste de fase), concentración espermática (cámara de Neubauer), funcionalidad de la membrana plasmática (HOS test), integridad acrosómica (IMA) (microscopía de contraste de fase) y porcentaje de Z con IMP (E/N). Para la evaluación simultánea de la IMP e IMA, se diluyó la muestra seminal en solución buffer fosfato hasta una concentración de 25x106Z/ml. Una alícuota de 50 ?l se incubó con 12,5 ?l de PSAFITC (0,01%) y 1?l de PI (0,05%) durante 15 min a 37°C. Se agregó 1,5?l de H (0,1%) continuando la incubación a la misma temperatura durante otros 15 min. Según su fluorescencia los Z se clasificaron en cuatro grupos. La aparición de color azul en la cabeza del mismo indica IMP (H+) e IMA (PSA/FITC-) intactas. Aquellos que además en la región anterior de la cabeza fluorescen en color verde evidencian IMP (H+) pero la membrana acrosomal está dañada (PSA/FITC+).

El daño en la membrana plasmática (PI+) con IMA (PSA/FITC-) se observa como una fluorescencia de color rojo, mientras que aquellos Z que presentan daño tanto en la membrana plasmática (PI+) como en la acrosomal (PSA/FITC+), presentan fluorescencia roja en la cabeza y verde en la porción anterior de la misma. Para realizar un análisis estadístico entre las técnicas se utilizó la prueba de Wilcoxon, para ello se utilizó el software Infostat versión 2011p

 

La evaluación de la IMP mediante la tinción de E/N arrojó un promedio de 69,07% +/- 15% de Z con membrana íntegra, mientras que la evaluación con la combinación PI y H resultó en un promedio de 64,11% +/- 15,15%. La evaluación de la IMA mediante microscopía de contraste de fase arrojó un promedio de 76,5% +/- 17,98% de Z con IMA, mientras que la evaluación con PSA-FITC resultó en un promedio de 66,43% +/- 17,25%. La valoración simultanea utilizando H y PSA-FITC arrojó un promedio de 52,17% +/- 16,26% de Z con IMP e IMA intactas, la media de Z positivos al PI y simultáneamente negativos al PSAFITC fue de 14,28% +/- 9,06%. Estos valores hacen referencia a aquellos Z que presentaron daño en la membrana plasmática pero no exhibieron daño alguno en la membrana acrosomal.

El promedio de Z que presentaron daño simultaneo en la membrana plasmática y acrosomal fue de 20,81% +/- 11,68%; en cambio la media de Z porcinos que presentaron su IMP pero exhibieron daño en la IMA fue de 12,72% +/- 9,26%. No se encontraron diferencias significativas al evaluar la IMP mediante la coloración con E/N o con los fluorocromos PI-H (p>0,05), mientras que al evaluar la IMA con PSA-FITC se detectó mayor daño acrosomal que al utilizar contraste de fase (p<0,05).

 

El protocolo utilizado fue seleccionado como el más adecuado para nuestro sistema de evaluación seminal. Se tuvieron en cuenta parámetros subjetivos como la obtención de una intensidad de coloración adecuada, la no interferencia de tinción entre los fluorocromos y la practicidad del procedimiento. Podemos concluir que se logró un protocolo adecuado para la valoración simultánea de la IMP e IMA de Z porcinos utilizando fluorocromos, el cual aporta datos de relevancia, ya que el deterioro de las membranas espermáticas es probablemente un factor relacionado a la subfertilidad o infertilidad masculina (Silva et. al 2006)

 

Mouiño Otero R. (2005). Nuevas tecnologías aplicadas al procesado y evaluación del semen bovino en centros de inseminación artificial ITEA Vol. 101 (3), 175-191

Silva P.F.N., Gadella B. M. (2006). Detection of damage in mammalian sperm cells. Theriogenology 65 958–978

Nolan J.; Graham, J.; Hammerstedt, R.; Artificial induction of exocytosis in bull sperm Archives of Biochemistry and Biophysics, Volume 292, Issue 1, Pages 311-322.

De Arruda R.P. (2007). Fluorescent Stain Method for the Simultaneous Determination of Mitochondrial Potential and Integrity of Plasma and Acrosomal Membranes in Boar Sperm Reprod Dom Anim 42, 190–194 ISSN 09366768