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C.-Técnicas de Cromatografía Liquida de Alta Resolución (HPLC)

Publicado: 17 de noviembre de 2003
Por: Alberto Gimeno
Este es uno de los Capítulos que pertenece al artículo completo titulado: Métodos de Análisis de Micotoxinas en Piensos Compuestos y Materias Primas (Revisión I).
C.1.- DETERMINACION DE LA AFLATOXINA B1

La técnica en la que tenemos más experiencia para el análisis de la aflatoxina B1 mediante la cromatografia de líquidos de alta resolución está perfectamente publicada con todos los detalles (50,51) para su aplicación en el laboratorio, con el titulo indicado más abajo:

El campo de aplicación de la técnica va referido a los alimentos compuestos, incluidos los que contienen pulpa de cítricos.

Nosotros hemos obtenido buenos resultados aplicando el método a: maíz, trigo, cebada, sorgo, arroz, centeno y subproductos de estos cereales, harina de soja, harina de cacahuete, harina de girasol, harina de coco, harina de palmiste, harina de colza, pulpa de remolacha, harina de linaza, cascara de almendra, mandioca, patatas secas y sus subproductos, piensos compuestos de aves, cerdos, rumiantes y conejos, hasta el momento no tiene sido aplicado a otros productos para alimentación animal.
C.1.1.- DETERMINACION DE LA AFLATOXINA B1 MEDIANTE CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (51)

1.- El método de análisis se basa en la separación mediante cromatografia de líquidos de alta resolución con detección por fluorescencia.

2.- La extracción de la muestra se realiza con cloroformo.

3.- Se filtra el extracto y una parte aliquota de éste se purifica en un cartucho de Florisil y,a continuación, en un cartucho de C18

4.- La separación y determinación finales se realizan mediante cromatografia de líquidos de alta resolución (HPLC) utilizando una columna de fase reversa (inversa) C18, seguida de una reacción de derivatización post-columna con solución acuosa de yodo.

La fase móvil consiste en una mezcla de agua+metanol+acetonitrilo (130+70+40) (v+v+v) que puede ser necesario ajustar la composición de los solventes de esta fase móvil, de acuerdo con las características de la columna HPLC utilizada.

5.- La detección se realiza por fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 365 nm y de emisión de 435 nm.

6.- Comparar el cromatograma del patrón de aflatoxina y de la muestra problema (tiempos de retención y demás).

7.- En caso de contaminación con aflatoxina, calcular como habitualmente en HPLC (medida del área de los picos y demás)

8.- La concentración mínima detectable se sitúa en 1 microgramo/Kg (0,001 mg/Kg).

NOTAS:
Atender bien a todas las observaciones efectuadas en las publicaciones (50,51), en especial:

a.- La forma y el proceso de lavado del material de vidrio ya que el uso de material de vidrio que no se haya lavado con ácido puede provocar perdida de aflatoxina en las soluciones acuosas de esta.

b.- En los análisis de micotoxinas, debe ser evitada la luz natural y luz solar directa, es aconsejable trabajar con luz de fluorescente.

c.- Proteger de la luz las soluciones de micotoxina (conservar en la oscuridad y utilizar hojas de papel de aluminio)
 
C.2.- ANALISIS DE FUMONISINAS B1 y B2

La técnica con la que tenemos más experiencia y que nos ha dado hasta ahora muy buenos resultados, está publicada en (52) con el titulo:

QUANTITATIVE DETERMINATION OF FUMONISINS B1 AND B2 BY HIGH-PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY WITH FLUORESCENCE DETECTION

En el articulo publicado no viene la técnica descrita paso a paso con todos los detalles para su aplicación en el laboratorio, la persona interesada podrá pedir la técnica completa al propio autor o autores, ver (52).

A pesar del método referirse especialmente a su aplicación en maíz y pienso de caballos, hemos obtenido buenos resultados aplicándolo a trigo, cebada, subproductos de trigo y maíz y piensos compuestos para aves, cerdos y rumiantes, hasta el momento no tiene sido aplicado a otros productos para alimentación animal.

La técnica se basa fundamentalmente en lo siguiente: La técnica se basa fundamentalmente en lo siguiente:

1.- 25 gramos de muestra son extractados con una mezcla de 50 ml de metanol+agua (3+1) por agitación ultrarapida durante 5 minutos.

2.- El extracto es centrifugado y el sobrenadante es filtrado a través de papel de filtro.

3.- Una aliquota de 10 ml de filtrado es introducida en un cartucho SAX (intercambiador de aniones) que previamente (antes de introducir los 10 ml) ha sido acondicionado con 5 ml de metanol, seguidos de 5 ml de metanol+agua (3+1).

4.- El cartucho es lavado con 8 ml de metanol+agua (3+1) seguido de 3 ml de metanol. La tasa de flujo es ajustada a 2 ml/minuto.

5.- Las fumonisinas B1 y B2 son eluidas con 14 ml de una mezcla de ácido acético en metanol al 0,5% y recogidos en un vial adecuado.

6.- El eluido es evaporado hasta casi sequedad a 60ºC, en corriente de nitrógeno seco y en un vial de 4 ml de capacidad.

7.- El vial anterior 5., es lavado con metanol y los lavados son introducidos en el vial anterior 6., de 4 ml de capacidad.

8.- Se continua la evaporación en las condiciones anteriores y se asegura que todo el ácido acético está evaporado.

9.- El extracto seco es mantenido a 4ºC antes del paso posterior del análisis por cromatografia de líquidos de alta resolución (HPLC).

10.- Seguidamente se procede a la derivatización del patrón de fumonisinas y de la muestra problema.



Derivatización del patrón y análisis HPLC

11. - A 50 microlitros del patrón conjunto de fumonisinas (50 microgramos de fumonisina B1/ml y 25 microgramos de fumonisina B2/ml, en una solución de acetonitrilo+agua (1+1) ), se añaden 200 microlitros del reactivo OPA (40 mg de ortophtaldialdeido + 1 ml de metanol y todo diluido con 5 ml de una solución 0,1 M de tetraborato disodico. Añadir después 50 microlitros de 2-mercaptoetanol).

12.- Mezclar y sin tardar más de un minuto después de la adición del reactivo OPA, inyectar 10 microlitros del derivado en la columna de HPLC (columna de fase reversa C18).

13.- La fase móvil consistirá en una mezcla de metanol+sodio dihidrogeno fosfato 0,1 M (80+20), ajustada a pH 3,3 con ácido ortofosforico. La tasa de flujo será de 1 ml/minuto.

14.- La detección se realiza por fluorescencia y las longitudes de onda en el detector de fluorescencia serán de 335 nm para la excitación y de 440 nm para la emisión.

Derivatización de la muestra problema y análisis HPLC

15.- Redisolver el extracto seco purificado 9, en 200 microlitros de metanol.

16.- Con 50 microlitros del extracto problema anterior 15, proceder como en 11 a 14 anterior.



Proceder después a:

17.- Comparar el cromatograma del patrón de fumonisinas y da la muestra problema (tiempos de retención y demás).

18.- En caso de contaminación con fumonisina, calcular como habitualmente en HPLC (medida del área de los picos y demás)

19.- Las recuperaciones son de: 99,5% y de 85,9% para las fumonisinas B1 y B2, respectivamente.

20.- Las concentraciones mínimas detectables, se sitúan en 10 microgramos/Kg para fumonisina B1 y en 20 microgramos/Kg para fumonisina B2.



Notas:

b.- En los análisis de micotoxinas, debe ser evitada la luz natural y luz solar directa, es aconsejable trabajar con luz de fluorescente.

c.- Proteger de la luz las soluciones de micotoxina (conservar en la oscuridad y utilizar hojas de papel de aluminio)



Para ver el Artículo completo, click aquí
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Alberto Gimeno
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Mario Bike Loya
25 de febrero de 2014
Me ayudara tanto con mi tesis, como lo cito? Mil gracias =D. Saludos desde Chihuahua, Mexico.
Jose Delmonte
13 de marzo de 2013
Les dejo el link de lo último en el tema. https://www.eae-publishing.com/catalog/details//store/es/book/978-3-659-06900-0/metodolog%C3%ADa-para-minimizar-la-incertidumbre-de-calibradores-en-hplc Saludos!
ALBERTO GIMENO
Alberto Gimeno
30 de noviembre de 2007
Apreciado Daniel, Gracias por sus felicitaciones. Un saludo. Gimeno
Daniel Franco González
17 de noviembre de 2007
Estimado Ing. Gimeno: Leí su artículo y me causó mucho interés, en la ciudad que vivo el daño a granos por micotoxinas se está siendo frecuente y las empresas elaboradoras de alimentos balanceados para animales tienen problemas principalmente con aflatoxinas, como estudiante universitario el conocimiento de esta manera de determinar micotoxinas me da un conocimiento nuevo sobre determinación de aflatoxinas, mis mas sinceras felicitaciones a usted por compartir sus conocimientos con su servidor. Gracias.
ALBERTO GIMENO
Alberto Gimeno
16 de noviembre de 2007
Apreciado José,

Si lee mi artículo titulado “Residuos de Aflatoxinas y Ocratoxina A en Alimentos de Origen Animal (Leche, Huevos, y Tejidos Comestibles)” publicado en www.engormix.com (sección: micotoxinas, idioma: español, artículos técnicos de Alberto Gimeno, ver listado completo de artículos técnicos), encontrará en la Tabla 2 y después de está, una amplia respuesta a su pregunta.

Un saludo.

Gimeno
José Mauro Arrieta.
José Mauro Arrieta.
16 de noviembre de 2007
Dr. Gimeno: Aprovechando su amplia experiencia en el tema, ¿tiene información sobre si hay transferencia de aflatoxina B1 o alguno de sus metabolitos al huevo en gallinas que consumen dietas contaminadas con Aflatoxinas? Atte. MVZ. Mauro Arrieta / Estado de México.
ALBERTO GIMENO
Alberto Gimeno
23 de marzo de 2007
Apreciada Olaya, Respecto a lo de la recuperación y a las interferencias, no se qué método está a utilizar para el análisis de Ocratoxina A, ni en qué tipo de productos aplica ese método. Hay metodologías en donde recuperaciones superiores al 100 pueden provenir de desvíos del método o de interferencias (a depender del sustrato) que el método no consigue eliminar. Si consulta el otro capítulo titulado “Técnicas de Análisis que utilizan una Columna de Inmunoafinidad, seguido de una Determinación por Medio de la Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (HPLC)” y que forma también parte de mi artículo completo titulado “Métodos de Análisis de Micotoxinas en Piensos Compuestos y Materias Primas (Revisión I)”, verá en ese capitulo que para el análisis de Ocratoxina A en cebada se utiliza (previo al HPLC) una columna de inmunoafinidad con anticuerpos monoclonales especificos de la Ocratoxina A. El método también va bien para maíz, trigo y piensos de cerdos. Las recuperaciones van por el orden de 93 a 95. Respecto a lo que me dice de métodos de genotoxicidad, no dispongo de suficiente información que le pueda ser útil. Un saludo. Gimeno
ALBERTO GIMENO
Alberto Gimeno
9 de marzo de 2007
Apreciado Dr. Alfredo,

En www.engormix.com (micotoxinas, artículos técnicos de Alberto Gimeno, ver listado completo de artículos técnicos), consulte mis artículos titulados:

“Aspergillus Micotoxicosis Comparativa Entre Pollos, Gallinas, Cerdos, Vacas Lecheras y Conejos”.

“Fusariomicotoxicosis comparativa entre pollos, gallinas, cerdos, vacas lecheras y conejos”.

En el primero encontrará la información que le he dado, y también bibliografía que le permitirá ampliar el tema, además de la bibliografía que ya está indicada en mi respuesta.

Un saludo.

Gimeno
alfredo canela
alfredo canela
8 de marzo de 2007
Muchas gracias, doctor, por su respuesta. Esa información que me dio, en qué artículo puedo encontrarla completa, porque me interesaría conocer más acerca de los experimentos que ha realizado. De antemano, muchas gracias. Mvz Alfredo Canela H
ALBERTO GIMENO
Alberto Gimeno
8 de marzo de 2007
Apreciado Dr. Alfredo, No creo que con lo que me habla de lo del pigmento y la concentración de monoésteres y diésteres sea una característica tan especifica como para diagnosticar una aflatoxicosis después del análisis por HPLC. La ocratoxina A, a pesar de ser eminentemente nefrotóxica, puede ocasionar también en el hígado anomalías como las que me menciona, aparte de una acumulación de glucógeno en los tejidos hepático y muscular. Le quiero indicar es que los pollos de engorde sólo son muy sensibles a la aflatoxina B1 cuando son muy jóvenes. A partir de una cierta edad, esa sensibilidad disminuye notablemente. Así pues: Contaminaciones con AFB1 de 75 a 800 ppb (microgramos/Kg) en alimentos compuestos, suministrados a pollitos de 1 día de vida en períodos de 3 á 10 semanas, provocaron una inhibición del desarrollo con las concentraciones más bajas, y lesiones hepáticas graves y muertes con las concentraciones más altas. Con 500 ppb y a las 3 semanas se observaron también problemas de hígado graso y aumento de su tamaño. Con 308 y 610 ppb, las mortalidades fueron de 8 y 11, respectivamente, entre las 0 y 9 semanas. Sin embargo, cuando dietas contaminadas con 2500 y 5000 ppb de AFB1 fueron dadas a pollos de 23 días de edad durante 32 días, no se observaron mayores problemas que los de un hígado ligeramente friable, y una reducción de la concentración de calcio en el suero, las lesiones histológicas fueron una vacuolización de los hepatocitos y una infiltración grasa (Fernandez et al, 1994). Estos resultados coinciden con los obtenidos por otros autores (Lanza et al, 1980). Vea Ud como con la edad los pollos son más resistentes a la acción tóxica de las aflatoxinas, ya que como habrá podido observar, esas últimas concentraciones de Aflatoxina B1 son muy elevadas. Fernández, A., Verde, M.T., Gascon, M., Ramos, J., Gomez, J., Luco, D.F., and Chavez, G. (1994). Avian Pathology, 23: 37-47. Lanza, G.M., Washburn, R.W., and Wyatt, R.D. (1980). Poultry Science, 59: 282-288. Un abrazo. Gimeno
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