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Estimación de la prevalencia de Streptoccoccus agalactiae, diagnosticado por la técnica PCR en hatos del Norte y Oriente de Antioquia, Colombia

Publicado: 21 de abril de 2016
Por: Ximena Cardona1,3, A. López Herrera2,3 y J. Echeverri Zuluaga2,31, 1Cooperativa Lechera COLANTA Ltda., 2 Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín, 3 Grupo de Investigación BIOGEM, Biodiversidad y Génetica Molecular
Resumen

La mastitis bovina se define como la inflamación de la glándula mamaria, caracterizada por cambios en el tejido y cambios físicos y químicos de la leche (Ballou, 2011). El S. agalactiae es conocido como el agente etiológico por excelencia de la mastitis clínica y subclínica en los bovinos (Dmitriew et al, 2002). El objetico de esta investigación fue determinar la prevalencia de mastitis ocasionada por Streptococcus agalactiae en dos importantes zonas lecheras en Colombia. Se analizaron 297 muestras de leche provenientes de cuartos de hembras bovinas diagnosticados por la prueba CMT con mastitis clínica y subclínica grado 3, procedentes de 13 municipios del norte y oriente antioqueño. Se estandarizaron las técnicas de biología molecular como la extracción de ADN bacteriano a partir de leche y la PCR, obteniéndose un fragmento de 586 pb del gen 16S rRNA en las muestra positivas para la presencia de S. agalactiae. Se estimó una prevalencia del S. agalactiae diagnosticado por la técnica PCR de 31 % en las muestras analizadas. Para analizar si existían diferencias de prevalencia del patógeno entre los 13 municipios donde se obtuvieron las muestras, se realizó una prueba de chi cuadrado. La prueba arrojó que existe diferencia estadísticamente significativa (P<0.05) en la prevalencia del S. agalactiae entre los diferentes municipios. Por otro lado, no se encontró diferencia estadística (P>0.05) entre la prevalencia evaluada en las dos zonas geográficas (norte y oriente antioqueño). Es importante la presencia del patógeno, sin embargo este no es el responsable de el porcentaje mayor de afectaciones de la glándula mamaria en las zonas estudiadas.

Palabras clave: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR), mastitis, vacas de leche, diagnóstico molecular.

Introducción
La mastitis bovina se describe como la inflamación del parénquima de la glándula mamaria, se caracteriza por cambios del tejido, y en algunos casos cambios físicos y químicos en el producto de su excreción (Ballou, 2011). El Streptococcus agalactiae es conocido como el agente etiológico por excelencia de la mastitis clínica y subclínica en los bovinos (Dmitriew et al, 2002).
El control de la mastitis es importante, dado que de esta condición sanitaria se derivan pérdidas financieras, efectos adversos, el bienestar de las vacas y posibles influencias en la salud pública. Las pérdidas financieras resultantes de la mastitis clínica surgen de los costos del tratamiento, mano de obra de médico veterinario y operarios, disminución de la producción, en la calidad y en el valor de la leche, descarte de leche y muerte de animales. El volumen de leche dejado de producir va de acuerdo a la severidad de la infección mamaria y oscila entre 2.8 y 45 % de la producción por cuarto/día (Philpot, 2001). Algunos estudios calculan que por cada duplicación en el RCS por encima de 100.000 células/mL, hay una perdida aproximadamente del 5 % en la producción de leche de la vaca afectada (Keefe & Chaffer, 2010). Estas pérdidas pueden llegar a representar aproximadamente el 38% de los costos directos totales de la producción. Las pérdidas mundiales, debido a la mastitis clínica y subclínica se consideran que representa el 70% de los gastos totales para los ganaderos lecheros, resultando en una pérdida de billones de dólares cada año (Bedolla, 2008). Se estima que un hato lechero en apariencia sano tiene entre 15 y 45 % de sus vacas en producción con mastitis subclínica en algún momento de su periodo de producción y que la capacidad potencial para producir leche se reduce hasta en un 35 % (Wattiaux, 2013). Se han estimado unas pérdidas totales anuales por mastitis equivalente a 1,3 kg de leche por vaca presente en el hato, así como 267 kg por cada caso de mastitis clínica (Villagómez & Cervantes, 2013).
Se ha encontrado para Colombia la mastitis como el principal factor depresor de la cantidad y la calidad de la producción de leche (Rodríguez, 2006). Martínez en 2006 calculó que la leche dejada de producir a causa de la mastitis bovina costaba COP 41.580 diarios en diez fincas de la Sabana de Bogotá. Pinzón y colaboradores en 2009, en el departamento de Boyacá, calcularon perdidas de COP 1´130.226 por día, y Trujillo y colaboradores en 2011, estimaron perdidas de COP 4´608.000 mensuales en siete hatos en el departamento de Antioquia.
Ramírez y colaboradores en 2010, realizaron 521 aislamientos microbiológicos de muestras de leche del norte de Antioquia y reportaron S. agalactiae en el 31.3 % de los cultivos realizados, siendo el patógeno de mayor frecuencia. Ramírez et al, en 2011, efectuaron 648 cultivos de muestras de leche provenientes del norte de Antioquia, de las cuales 23.9 % fueron negativas, 34 % positivas a Streptococcus agalactiae y 10.2 % a Staphylococcus coagulasa negativo. Otro estudio en lechería especializada fue realizado por Becerra et al, 2014, llevado a cabo en el Altiplano Boyacense donde se evaluaron 5396 cuartos, en 1349 vacas en ordeño, donde se aislaron principalmente Streptococcus agalactiae (9.7 %); otros Streptococcus (4.1 %); Staphylococcus aureus (8.3 %); otros Staphylococcus Coagulasa Positiva (0.55 %); Staphylococcus Coagulasa Negativa (0.46 %); Actinomycespiogenes (1.3 %); Levaduras (0.7 %); Escherichia coli (0.6 %); Corynebacterium(0.6 %); mixtos Streptococcus + Staphylococcus (0.8 %); otras mixtas (4.5 %); Acholeplasma (1.4 %) y Mycoplasmasspp. (2.2%).
 
Materiales y Métodos
Para la estandarización de las técnicas de biología molecular se colectaron 12 muestras de leche cruda de cuartos con mastitis clínica de hembras bovinas de hatos lecheros. El ADN bacteriano se extrajo mediante dos metodologías. La primera mediante Fenol- Cloroformo, descrita por Potou en 2005, con modificaciones, así: se tomó 1.5 mL de cada muestra de leche en tubos eppendorf y se centrifugó a 12.000 RPM (Revoluciones Por Minuto) por 5 minutos para descartar agua y grasa. Se adicionó 500 μL de buffer TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA), 30 μL de SDS 20 % y 30 μL de proteinasa K (20 mg/mL) (Invitrogen), y se incubó durante 1 hora a 37 º C. Pasado este tiempo, las muestras se agitaron con vortex y se adicionó un volumen igual de Fenol-Cloroformo-Isoamilico (25:24:1). Por agitación, se formó una emulsión, se centrifugó a 13.000 RPM durante 5 minutos a temperatura ambiente y se transfirió la fase superior acuosa a un nuevo vial. Se adicionó un volumen igual de Fenol- Cloroformo-Isoamilico (25:24:1), se mezcló por inmersión hasta que las fases se entremezclaran y se centrifugó a 13.000 RPM por 3 minutos. Se trasfirió la fase superior a nuevo vial de 1.5 mL y se adicionó 1/10 de volumen de acetato de sodio 2M y un volumen de etanol absoluto a – 20 º C. Se realizó la mezcla por inversión de los componentes y nuevamente se centrifugó a 13.000 RPM durante 5 minutos y posteriormente se descartó el sobrenadante. El botón de ADN se lavó con 500 μL de etanol al 70% y se resuspendió en 100 μL de buffer TE 1X y se almacenó a – 20 º C para su posterior uso. El segundo método consistió en la extracción de ADN con el kit DNeasy blood and tissue Qiagen®, de acuerdo a las recomendaciones realizadas por la casa fabricante (Qiagen, 2006). Con la primera metodología se extrajo el ADN de 6 muestras de leche y con la segunda metodología las 6 muestras restantes.
Mediante la técnica de PCR se amplificó un fragmento de 586 pb del gen 16S rRNA de Streptococcus agalactiae. Los primers utilizados tienen la siguiente secuencia de nucleótidos: F -5´- CGT TGG TAG GAG TGG AAA AT - 3'; R - 5' - CTG CTC CGA AGA GAA AGC CT- 3' (Riffon et al, 2 contenía: 200 nanogramos de ADN; Buffer 10X; MgCL2 25 mM; dNTPS 200 mM, 0.5 μM de primers y 5 U de Taq ADN polimerasa (Fermentas). La PCR se corrió en un termociclador Bio-Rad Termal cycler C1000®, con el siguiente perfil térmico: un ciclo inicial de desnaturalización de 94 º C por 2 minutos, 35 ciclos en las siguientes condiciones: 94 º C por 45 segundos para desnaturalización, 65 º C por 1 minuto para anneling y 72 º C por 2 minutos para extensión. Un ciclo final de extensión a 72 º C durante 10 minutos. Toda PCR implicó la amplificación del fragmento de 586 pb del gen 16s rRNA en el control positivo: ADN de la cepa ATCC 13813 (American Type Cultive Collection) y la ausencia de amplificación del fragmento en el control negativo que consistió en una mezcla de reacción donde se reemplazó el ADN por agua.
Posteriormente, 297 muestras de leche cruda tomadas de cuartos diagnosticados por la prueba CMT con mastitis clínica y subclínica grado 3 de hembras bovinas de los 13 hatos lecheros fueron utilizadas para determinar la prevalencia, para ello se utilizo el siguiente acercamiento matemático: 
__ N° casos positivos__ x 100  N° casos totales
Una comparación de chi cuadrado fue utilizada para la comparación de las frecuencias de infección encontradas en los diferentes municipios y en las zonas estudiadas. 
 
Resultados
Prevalencia de Streptococcus agalactiae en hatos del norte y oriente antioqueño. De 297 ADN extraídos de muestras de leche provenientes de cuartos de vacas con mastitis clínica y subclínica (grado 3), 92 se diagnosticaron positivas para S. agalactiae por PCR, lo que representa un 31 % de la población estudiada. 
En la tabla 1 se presentan los municipios del Norte y Oriente de Antioquia muestreados, el número de muestras de leche tomadas en cada municipio y el número de muestras positivas para S. agalactiae por PCR.
Para analizar si existían diferencias estadísticas entre la prevalencia del patógeno en los 13 municipios donde se obtuvieron las muestras, se realizó una prueba de Chi cuadrado La prueba arrojó que existe diferencia estadísticamente significativa (P<0.05) en la prevalencia del S. agalactiae entre los diferentes municipios. Por otro lado, no se encontró diferencia estadística (P>0.05) entre la prevalencia evaluada en las dos zonas geográficas (norte y oriente antioqueño).
Con base en las experiencia s de otros países, especialistas nacionales e internacionales han investigado el Streptococcus agalactiae en las circunstancias singulares de Colombia, encontrando que es un patógeno prevalente en los tanques de enfriamiento de la industria lechera de nuestro país (Keefe y Chaffer, 2010). Ramírez y colaboradores en 2001, realizaron CMT a cada cuarto de 112 vacas lactantes en el municipio de San Pedro de los Milagros, Antioquia, y a los cuartos positivos al CMT se les tomó muestra de leche para realizar recuento celular, cultivo y antibiograma. En los cultivos de los cuartos afectados (55 cuartos), la bacteria más frecuentemente aislada fue el Streptococcus agalactiae, seguida de SCN (StaphylococcusCoagulasa Negativo) y Staphylococccus aureus con un 47 %, 14.6 %, y 13 %, respectivamente. Rodríguez en 2006, reportó la evaluación que realizó a 644 vacas distribuidas en 10 hatos en la Sabana de Bogotá enfocándose en el estudio de la mastitis por dos años. Los resultados agrupados indicaron que el Streptococcus agalactiae fue el principal patógeno en todos los hatos estudiados, pero tales prevalencias eran mayores en los sistemas con ordeño manual. Ramírez y colaboradores en 2010, realizaron 521 aislamientos microbiológicos de muestras de leche del norte de Antioquia y reportando S. agalactiae en el 31.3 % de los cultivos realizados, siendo el patógeno de mayor frecuencia. El patrón de la infección es similar al encontrado en otros países. Ferraro y colaboradores, analizaron por CMT 24599 cuartos de 6405 vacas de 60 fincas lecheras en 13 estados de Venezuela. 2982 muestras de leche se cultivaron para diagnostico microbiológico, donde el patógeno más común fue el Streptococcus agalactiae (37.8 %). Cordero y colaboradores en 1991, analizaron por CMT un total de 509 vacas de 30 fincas lecheras en la provincia de Cartago, Costa Rica.
Todos los cuartos positivos se cultivaron.
 Estimación de la prevalencia de Streptoccoccus agalactiae, diagnosticado por la técnica PCR en hatos del Norte y Oriente de Antioquia, Colombia - Image 1
 
La prevalencia de mastitis subclínica fue del 42.2% y la bacteria más común encontrada fue el Streptococcus agalactiae (17.7 %). En Canadá, los niveles de infección por S. agalactiae en el rebaño van desde 11% reportado en 1991 en el estado de Alberta, hasta 47 % en el estado de Vermont en 1985 (Keefe, 1997). Por su parte, Calderón y Rodríguez en 2008, evaluaron 11416 cuartos pertenecientes a 2854 vacas de 40 fincas especializadas en la producción de leche en el altiplano cundiboyacense mediante la prueba de CMT. 3931 resultaron positivos (casos clínicos y subclínicos grado 3) y fueron muestreados para aislar los microorganismos involucrados en la infección mamaria. 49.01% de los aislamientos involucraron microorganismos infecciosos. Sin embargo, el Streptococcus agalactiae fue aislado solo en el 6.84 % de las muestras. Las infecciones mixtas representaron el 1.2 % y la asociación más frecuente fue la de Streptococcus agalactiae y Staphylococcus aureus. De igual manera, Calderón y colaboradores en 2011, cultivaron 480 muestras de leche para aislar microorganismos involucrados en mastitis en cuartos subclínicos y clínicos para CMT en fincas del municipio de Montería (Córdoba). El Staphylococcus aureus, fue aislado en el 87.56 %, Streptococuss uberis aislado en el 3.60 % y el Streptococcus agalactiae al igual que el Corynebacteriumbovis se aisló solo en el 2.10 % de las muestras.
 
Referencias
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Calderon, R., Rodríguez, R., Arrieta, B., Mattar, V. 2011. Prevalencia de mastitis bovina en sistemas doble propósito en Montería (Colombia): etiología y susceptibilidad antibacteriana. Revista Colombiana de Ciencias Pecuarias, 24(1): 19-28.
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Autores:
Albeiro López Herrera
Universidad Nacional De Colombia (UNAL)
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