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Actividad antibacteriana de nanopartículas de plata contra un aislado de staphylococcus aureus multidroga-resistente obtenido de un caso de mastitis bovina

Publicado: 15 de mayo de 2017
Por: J Brisuela Raygosa1 , J Palacios Torres1 , G Felipe García1 , JC Herrera Ramírez1 , S Hori-Oshima1 , G López Valencia1 , J L Stephano Hornedo2 , TB Rentería Evangelista1 , GE Medina Basulto1
Resumen

La mastitis bovina es una enfermedad de alto impacto económico para la industria lechera. Al ser provocada principalmente por bacterias, el tratamiento más utilizado es con antibióticos, sin embargo se ha demostrado que bacterias aisladas de mastitis presentan resistencia a estos. En este trabajo se determinó el efecto microbicida de nanopartículas de plata contra un aislado de S. aureus multidroga-resistente de un caso de mastitis bovina. Se probaron distintas concentraciones de nanoplata y tiempos de incubación en los medios diluyentes: agua ultrapura, leche descremada, solución buffer fosfato y caldo Todd Hewitt (TH). Se sembró en agar TH cada muestra para determinar la concentración mínima bactericida (CMB). La CMB de nanoplata en agua fue de 4µg/ml a los 30 minutos, en solución buffer fosfato de 8µg/ml a las dos horas y en leche fue de 16µg/ml a las cuatro horas de incubación.

Introducción
La mastitis bovina es una inflamación de uno o varios cuartos mamarios, debida con mayor frecuencia a una infección intramamaria bacteriana. Es una de las enfermedades más importantes en el ganado lechero ya que reduce la producción de leche y altera su composición (Bradley, 2002). La principal forma de tratar la mastitis bovina actualmente, es la terapia con antibióticos, sin embargo, hay inconvenientes debidos entre otras causas a su uso con fines profilácticos, lo que favorece la selección de cepas resistentes en la población microbiana e influye negativamente en el tratamiento de la enfermedad.
Entre los agentes antimicrobianos inorgánicos, la plata ha sido ampliamente utilizada desde tiempos remotos para combatir infecciones (Pal et al., 2007). El uso de materiales con dimensiones en escala molecular, se ha venido incrementando en aplicaciones médicas para utilizarlas como agentes antimicrobianos (Sondi y Salopek, 2004).
Se ha reportado que las nanopartículas de plata poseen un enorme potencial para su uso médico, en virtud de su actividad antimicrobiana de amplio espectro incluyendo bacterias multidrogaresistentes, además de ser relativamente no tóxicas y seguras y requerir concentraciones muy bajas para conseguir un efecto microbicida (Panacek, A., et al., 2006). Por lo anterior, el objetivo de este estudio fue probar el efecto microbicida de nanoparticulas de plata contra S. aureus multidroga-resistente aislado de mastitis bovina, utilizando distintos diluyentes, para observar el comportamiento de la nanoplata en cada uno de éstos.
 
Materiales y Métodos
Material biológico: La cepa S. aureus MDR se aisló de mastitis subclínica bovina, se identificó mediante PCR utilizando oligonucleótidos específicos diseñados de una región que codifica para el gen 23S ribosomal, y se le hizo prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos utilizando el método de difusión en agar Bio Rad Multidiscos Gram positivos® con 12 antibióticos. Es una cepa no susceptible a 6 antibióticos, entre ellos: 4 betalactámicos, 1 fluorquinolona y 1 macrólido, la cual se conserva liofilizada y criopreservada en glicerol al 10%. Para el ensayo se utilizó cultivo fresco en fase exponencial en caldo Todd Hewitt. Al momento de comenzar el ensayo se diluyó con PBS 0.01M hasta obtener una turbidez 0.5 del estándar McFarland, lo que equivale a 1.5 x 108 ufc/ml aproximadamente y se probó con diferentes concentraciones de nanoplata.
Nanopartículas de Ag: Son nanoparticulas comerciales de la marca Argovit esféricas de 3 nm de diámetro cubiertas con el polímero polivinilpirrolidona (PVP).
Medios diluyentes: Los medios diluyentes a probar fueron: Agua ultra pura, Solución buffer fosfato (PBS) 0.01M (pH 7.4), Caldo Todd Hewitt (pH 7.8±0.2) y leche descremada al 10% (pH 6.3 ± 0.2).
Aplicación de nanoplata in vitro: El ensayo se realizó en microplacas estériles de polietileno de 330µl. Aproximadamente 106 ufc/ml de S. aureus en fase exponencial se inocularon, luego se agregaron distintas concentraciones de nanoplata. La más baja fue de 0.5 µg/ml y la más alta de 32 µg/ml de un stock de 32µg/ml diluido en cada uno de los medios. Además se incluyeron controles positivos y negativos, el primero fue bacteria en medio sin nanoplata y el segundo fue solamente medio. Se aforó cada muestra a 300µl con el medio correspondiente, todos estos pasos se llevaron a cabo con condición aséptica en una cabina de flujo de aire laminar. Después se incubó por distintos tiempos, el tiempo más corto fue de 30 minutos y el más prolongado fue de 16 horas, a 37°C a 200rpm, en ambiente estéril.
Ensayo de actividad antimicrobiana de nanoparticulas de plata contra S. aureus MDR: Para evaluar la CMB de la nanoplata, se inocularon 10µl de cada muestra al término de su tiempo de incubación correspondiente en cajas de Petri con agar Todd Hewitt y se incubaron por 24 hrs a 37 °C.
 
Resultados y discusión
Utilizando agua ultrapura la CMB fue de 4µg/ml desde los 30 minutos, sin embargo este corto tiempo pudo deberse a que no era un ambiente óptimo y sin nutrientes para las bacterias, en cambio se obtuvo una CMB de 8µg/ml a las dos horas en el medio de PBS 0.01M, tampoco tenían nutrientes pero al ser un medio isotónico no es un medio tóxico, en el medio de leche descremada la CMB fue de 16µg/ml a las dos horas de incubación, con este medio tardó un poco más en lisar en comparación con los medios anteriores, posiblemente porque es un medio con nutrientes donde se desarrollan con facilidad las bacterias. En caldo, al ser este un medio rico en nutrientes, posiblemente no pudo actuar eficientemente la nanoplata, lo mismo pudo haber sucedido con el caldo Todd Hewitt ya que no hubo lisis en ninguna concentración.
El ensayo que presentamos es similar al de Suchomel y colab. (2015) y al de Kvitek y colab. (2008) donde también probaron nanoplata cubierta con PVP contra S. aureus pero solo utilizaron caldo Muller Hinton como medio diluyente, en nuestro ensayo probamos con distintos medios. Sin embargo la concentración mínima inhibitoria (MIC, por sus siglas en inglés) del ensayo de Suchomel y colab. fue de 10.1µg/ml y en el de Kvitek y colab. fue de 3.38µg/ml, ambos expusieron la bacteria con la nanoplata por 24 horas, en nuestro trabajo el tiempo máximo fue de 16 horas, además la MIC de nuestro ensayo debió haber sido menor que la CMB que obtuvimos, por lo que es necesario para ensayos posteriores determinar la MIC e incubar hasta 24 horas para poder discriminar con mayor precisión la MIC y la CMB.
La intención de probar con distintos medios en nuestro ensayo fue para observar el comportamiento de la nanoplata, con el objetivo de en un futuro poder utilizarlos como vehículo para la aplicación intramamaria en las vacas infectadas con mastitis o como preventivo. Al obtener estos resultados, descubrimos que la nanoplata utilizada si posee efecto microbicida contra S. aureus MDR a concentraciones muy inferiores a las de antibióticos comunes de uso veterinario.
 
Actividad antibacteriana de nanoplata en distintas concentraciones, tiempos de incubación y medios diluyentes. (+++, ++, + = Crecimiento bacteriano. - = Lisis total).
Actividad antibacteriana de nanopartículas de plata contra un aislado de staphylococcus aureus multidroga-resistente obtenido de un caso de mastitis bovina - Image 1
 
Literatura Citada
Bradley, A. 2002. Bovine mastitis an evolving disease. Vet. J. 164:116-126.
Kvitek, L., A. Panacek, J. Soukupova, M. Kolar, R. Vecerova, R. Prucek, M. Holecova and R. Zboril. 2008. Effect of surfactants and polymers on stability and antimicrobial activity of silver nanoparticles (NPs). J. Phys. Chem 112: 5825-5834.
Pal, S., Y. K. Tak and J. M. Song. 2007. Does the antibacterial activity of silver nanoparticles depend on the shape of the nanoparticle? A study of the Gram-negative bacterium Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 73(6) 1712-1720.
Panacek, A., L. Kvitek and R. Prucek. 2006. Silver colloid nanoparticles: synthesis, characterization and their antibacterial activity. J. Phys. Chem. B. 110:16248–16253.
Sondi, S. and B. Salopek-Sondi. 2004. Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a case study on E. coli as a model for Gram-negative bacteria. Journal of colloid and Interfase Sciencie. 275:177-182.
Suchomel, P., L. Kvitek, A. Panacek, R. Prucek, J. Hrbac, R. Vecerova and R. Zboril. 2015. Comparative study of antimicrobial activity of AgBr and Ag Nanoparticles (NPs). PLoS ONE 10(3): e0119202.
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Autores:
Gerardo Medina Basulto
Universidad Autónoma de Baja California (UABC)
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Gerardo Medina Basulto
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Raul Jesus Santivañez
Agropecuaria Tayanga
24 de noviembre de 2019
Amigos del foro : Soy un convencido que tenemos que buscar nuevas practicaras y terapias en el tratamiento de nuestras mastitis, las bacterias incluidas en estos procesos son cada ves mas resistentes a los antibióticos de nuestra batería anti microbiana y los laboratorios no encuentran nuevas drçogas para el control de este gran problema. Lo importante de los trabajos es su eficacia en vivo, pues todos sabemos que el efecto de cualquier droga in vitro (en el laboratorio) es muy distinto a su comportamiento in vivo ( en el animal); es por ello que felicito a los autores del trabajo pero les suplico que continúen su trabajo con animales , es sabido el gran efecto que tiene la plata en las quemaduras pero esto es local seria muy importante conocer mas sobre su comportamiento en el metabolismo de los animales . Yo he empleado las soluciones de nitrato de plata para secar o clausurar en forma permanente los cuartos afectados con mastitis crónicas con excelentes resultados. Saludos desde el norte del Perú . Raúl.
Pablo  De  Maria
17 de mayo de 2017
Los felicito por esta innovadora investigación para que en un futuro no muy lejano desterremos los antibioticos para curar mastitis . Comentario : hace muchos años vi un articulo en la revista Therios ( argentina ) de un ensayo de cura de mastitis con soluciones sobresaturadas de azúcar que mata por ósmosis. Pero nunca más vi nada. Hay trabajos de aumentar la inmunidad y curación ( self cure ) con polisacaridos ( GRAM 100 ) del laboratorio Puebla, Argentina con muy buenos resultados. Agregue estas 2 cosas que no tienen nada que ver con las nanoparticulas por si a alguien le interesa. Sds Pablo
Luis Bojorquez
Laboratorios Avilab
16 de marzo de 2020
Los felicito por este artículo y de acuerdo, se requiere conocer más sobre el mecanismo de la planta como antimicrobianos
BAYARDO RENANORTEGA PONCE
11 de marzo de 2020
La plata coloidal sirve para el timpanismo en bovinos? Y q dosis se emplearia para prevenir y curar. Muchas gracias.
Guillermo Barahona
Sociedad Cooperativa Ganadera de Sonsonate de R.L de C.V
18 de enero de 2020
Felicito a los autores de este artículo. Trabajo en una cooperativa de ganaderos y procesamos la leche que producen. Es un problema muy grande para las ganaderías el uso de antibióticos para controlar la mastitis. El uso de plata iónica sería un camino a seguir luz para curar esta enfermedad. Por lo poco que sabemos, creo que la plata iónica tomada en rumiantes no tendría el efecto esperado para el control de la mastitis. Podría tener buenos resultados en forma de infusión intramamaria e inyectada. Por favor continúen con las investigaciones.
Hugo Leiva K.
LHA Salud Animal
26 de noviembre de 2019

Muy buenas tardes Colegas desde Colombia. La plata tiene una accion germicida, antiviral y antibacterial efectiva sin efectos 2.Puede administrarse via oral. En colombia se consigue como Argentum metallicum LHA

Enrique Oscar Lopez
Laboratorios Puebla
20 de octubre de 2019
Hay que ver cómo sería usado y que efectos tendría una vez dentro del organismo.
Luis Mansilla
7 de agosto de 2019
Buenos días, es meritorio hacer mención que no obstante a que se reconoce que la Ag iónica es la responsable de la actividad antimicrobiana; la modalidad por el cual actúan letalmente con las células bacterianas no se ha establecido aún. Por esa razón, diversos estudios han establecido de hasta 4 mecanismos intracelulares protagónicos para que ocurre el desenlace de la muerte celular. En todos ellos, la unión de la Ag a la membrana celular y su absorción intracelular es el 1er. proceso inevitable, considerando que las bacterias injuriantes en los cuadros mastíticos en el bovino; acumulan Ag de las AgNPs (bioacumulación), hasta que ocurra la apoptosis celular. .
Luis Mansilla
6 de agosto de 2019
Buenas noches Dr. Medina, me siento sinceramente complacido por la destacada calidad académica de su trabajo y el aporte que brindará a los ganaderos productores de leche, en un futuro cercano. Efectivamente, existen varios estudios sobre el tema. Solo haré mención de 2 de ellos: Con un tamaño promedio de 25 nm, se llegó a demostrar una alta actividad antimicrobiana y bactericida de las nanopartículas de Ag contra bacterias Gram + y Gram -, incluidas cepas altamente multirresistentes como Staphylococcus aureus; resistente curiosamente a la meticilina y se pudo llegar a descubrir que la actividad antibacteriana de las nanopartículas de Ag está supeditada al tamaño de las mismas. Concentraciones bastante bajas de Ag (como 1,69 µg / ml) dió un rendimiento antibacteriano destacable (Panacek, A., et al., 2006). En otro trabajo también se llegó comprobar con Nanopartículas de Ag. comerciales, la inhibición del 100 % de crecimiento bacteriano de E. coli y S. aureus, pero para Salmonella spp. se inhibió el 91 % de crecimiento bacteriano con una concentración de solo 7.93 mg/L. (Flores González, M., 2017). Apreciados Foristas ello demuestra el amplio espectro antibacteriano y la versatilidad de las Nanoparticulas de Ag en su ataque a bacterias Gram + (E. Aureus) y Gram - (Ej. E. Coli), que tienen un protagonismo importante; dada sus caracterizaciones moleculares de genes codificantes a factores de virulencia, en los cuadros de Mastitis en el ganado lechero.
Pamela Poblete K.
17 de mayo de 2017
Interesante, pensando q hay cada vez más resistencia bacteriana a antibióticos y que en un futuro no muy lejano además aumentarán las restricciones legales y comerciales precisamente pensando en prevenir la aparición de nuevas cepas resistentes. Claramente falta investigación en este ámbito, pero se está avanzando. A ver cuando se publica algo sobre pruebas in vivo como tratamiento contra mastitis.
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