Caracterización de proteínas de transferencia de lípidos (ltps) en Lotus Japonicus: regulación y señalización hormonal durante estrés hídrico.

La cutícula es la primera barrera de defensa y la segunda vía de pérdida de agua en los órganos aéreos de las plantas. Por esta razón es importante conocer cómo se controla su formación y que factores están implicados en promover su biosíntesis. El objeto de este estudio es conocer el rol de una proteína de transferencia de lípidos (LTP) en Lotus japonicus, una especie muy emparentada con algunas de las leguminosas forrajeras más conocidas. Este gen es altamente expresado frente a estrés hídrico.

Semillas de Lotus japonicus Gifu fueron germinadas y luego de tres meses de desarrollo en una mezcla de vermiculita: suelo (5:1) fueron sometidas a los siguientes tratamientos: (1) Irrigación baja para mantener una condición de contenido relativo de agua (RWC) = 60-70%, (2) Acido Abscisico 20uM, Peróxido de hidrógeno 2%, Etileno 2%, Metiljasmonato 400uM. Las muestras de tejido fueron tomadas luego de 3, 8 y 24 horas después de comenzado los tratamientos.

Para la determinación de elongación de tallo y permeabilidad epidérmica se utilizaron plantas de una edad de tres meses las cuales fueron cortadas y mantenidas por 15 días en dos tratamientos de humedad (100ml o 10ml de riego semanal). La elongación relativa del tallo (RSE) fue expresada como Ln (SE) en función del tiempo.

El RNA total fue extraído desde hojas, tallos y brotes utilizando el kit SV Total RNA isolation system (Promega). La calidad y cantidad de RNA fueron evaluadas en gel denaturante y espectrofotómetro respectivamente. La síntesis de cDNA fue realizada usando Superscript RT-PCR system (Invitrogen) a partir de 500 ng de RNA total. Los estudios de Real time-PCR así como los primers utilizados fueron los descritos en Tapia et al. (2013).

En esta investigación se identificaron 58 genes codificantes para LTPs en el genoma de Lotus japonicus, las cuales fueron clasificadas de acuerdo a su secuencia en 7 grupos. Se realizaron estudios de modelamiento in silico con el fin de conocer su estructura e identificar posibles ligandos. Los estudios de afinidad mostraron que de 15 lípidos analizados como posibles ligandos, palmitoil-CoA resultó ser el mejor. Durante el tratamiento de estrés hídrico las plantas de L.japonicus mostraron una reducción en la permeabilidad cuticular de la hoja y una reducción en la elongación relativa de tallo de las plantas (Figura 1). Los genes LjLTP6 y LjLTP10 son inducidos por estrés hídrico (Figura 2), donde LjLTP10 muestra ser regulado frente al tratamiento con metiljasmonato, no así claramente por ABA, peróxido de hidrógeno ni etileno (Figura 3).

Los resultados sugieren que esta LTP participa activamente en el transporte de lípidos cuticulares promoviendo tolerancia a estrés hídrico aunque también podrían poseer un rol en desarrollo de los órganos aéreos de la planta.

Figura 1. Crecimiento de plantas, permeabilidad cuticular durante estrés hídrico. Razón de perdida de agua en hojas en función del tiempo (a), Elongación relativa de tallo (b) Control no tratada y estrés hídrico son indicadas como círculos y triángulos respectivamente. Cada medición corresponde a la media ±SD (n=6 réplicas).

Figura 2. Análisis de Real time PCR para los genes LjLTP6 (a), LjLTP8 (b), LjLTP9 (c), LjLTP10 (d), en brotes (Sh), hojas maduras (Ml) y tallos (St).

Figura 3. (A) Análisis de Real-time PCR para LjLTP6 y LjLTP10 frente a señales hormonales. Expresión en brotes para plantas sin tratamiento (C), Acido abscisico (ABA), peróxido (Per) y etileno (Et). (B) Análisis de expresión génica para LjLTP6 (Triangulo) y LjLTP10 (Circulo) frente a tratamiento con metiljasmonato en una cinética a 24 horas.

LjLTP10 es inducido fuertemente por estrés hídrico en L. japonicus, en las células epidérmicas de hojas, tallos y brotes. Por tanto, LjLTP10 podría estar implicada en procesos tales como transporte de ceras en la cutícula y tener un rol en tolerancia a sequía, aunque tampoco se descarta su rol en procesos de desarrollo vegetativo. Su regulación mediada por metiljasmonato sugiere un rol regulatorio de este último en señalización de estrés.

TAPIA G, MORALES-QUINTANA L, PARRA C, BERBEL A, ALCORTA M. 2013. Study of nsLTPs in Lotus japonicus genome reveal a specific epidermal cell member (LjLTP10) regulated by drought stress in aerial organs with a putative role in cutin formation. Plant Mol Biol. 82(4-5):485-501.