Primera ternera murciano-levantina obtenida por biotecnología reproductiva (OPU, fecundación in vitro, cultivo in vitro y vitrificación de embriones)

Según la FA, 14 razas de animales de producción proporcionan actualmente el 90% de los alimentos consumidos. De 7.600 razas de animales de granja existentes 1.500 (20%) están declaradas en peligro de extinción. En todo el mundo se extingue una raza al mes, habiéndose erradicado, en los últimos 15 años, unas 190; en los últimos 5 años han desaparecido del planeta 60 razas de cabras, cerdos, caballos y aves de corral (FAO, 2006). Por todo ello, la FAO ha establecido programas para el mantenimiento de la diversidad de animales de granja. La raza bovina Murciano-Levantina es una raza autóctona que está considerada en situación crítica según la Sociedad Española de Recursos Genéticos Animales (SERGA) en base a los criterios FAO. El censo de ejemplares en 2010 se estima en unos 64 reproductores. Existe una gran preocupación sobre el futuro de la raza porque la tenencia recae sobre personas cuya actividad profesional no es la producción animal. El sistema de manejo reproductivo que se sigue actualmente emplea la IA y la monta natural, siendo necesarios otros métodos que puedan garantizar la continuidad de la misma.

Las grandes expectativas creadas por los procedimientos de producción de embriones in vivo no se han cumplido en su totalidad (Herradón et al., 2007). Estas circunstancias han creado la necesidad de desarrollar procedimientos alternativos como es la producción de embriones in vitro (PIV) utilizando ovocitos inmaduros, recogidos directamente del ovario, con independencia de la edad y de la situación fisiológica de la hembra. La obtención de los ovocitos se realiza a partir del animal vivo, mediante aspiración de los folículos ováricos, utilizando la aspiración transvaginal ecoguiada (OPU).

Por todo ello, y teniendo como objetivo claro el tomar medidas propias de la conservación ex situ de la raza Murciano-Levantina se optó por la producción in vitro de embriones a partir de ovocitos obtenidos por OPU, para su posterior crioconservación mediante vitrificación y transferencia embrionaria a hembras receptoras de otras razas.

Las hembras donantes utilizadas en el proyecto son vacas de raza Murciano-Levantina, de condiciones sanitarias adecuadas. La madre biológica de la ternera nacida, aquí presentada, fue una novilla de raza Murciano-Levantina de 30 meses de edad. La punción se realizó sobre dos hembras de esta raza, el mismo día, con el fin de elevar el número de ovocitos recuperados y mejorar las tasas de éxito. OPU (Ovum pick-up): se siguió el protocolo de estimulación hormonal descrito por Chaubal et al. (2006) con retirada del folículo dominante mediante administración de GnRH (0,2 mg i.m., Dalmarelin®, Fatro Ibérica, Barcelona, España), 48 h más tarde 500 UI FSH-LH i.m. (Pluset®, Calier, Barcelona, España;) y OPU, 48 h más tarde. Una hora antes de la OPU se aplica a los animales carprofeno 50 mg/ml (s.c.) a dosis de 1,4 mg /kg p.v. (Rymadil®, Pfizer AH, Paris, Francia) para evitar dolor, garantizar bienestar y mejorar la eficacia reproductiva. La OPU precisa de la tranquilización mediante 0,25 ml/100 kg de xilacina (i.m.) al 2% (Rompun®, Bayer, Bayer Leverkusen, Alemania). Posteriormente, se debe administrar procaína (Procasel® 2%, 5-7 ml/animal) vía epidural. Para la visualización de los folículos ováricos empleamos un ecógrafo Pie Medical (mod. FalcoVET) equipado con una sonda transvaginal (Pie Medical R-10) de 5-7,5 MHz y un “handgrip” o mango de OPU de 60 cm de longitud. El equipo de OPU se completa con una bomba de vacío (Aspirator 3, Labotect) accionada por pedal, aplicando una fuerza de aspiración constante de 50-53 mm Hg (20 ml/min). Los ovarios se posicionan delante de la sonda y se aspiran los folículos ováricos de más de 3 mm de diámetro. El medio de lavado y recogida de ovocitos es PBS suplementado con heparina sódica (2,2 UI/ml) y suero bovino fetal (SBF) (1%). Posteriormente, se evalúan los complejos cúmulo-ovocito (CCOs), clasificados según Oropeza et al. (2004), donde los CCOs de las categorías I-III se consideran aptos para su procesamiento in vitro.

Producción de embriones in vitro (PIV): para la maduración in vitro se cultivan los ovocitos durante 24 h en OMM (Oocyte Maturation Medium) suplementado con hormonas (10 UI/ml eCG y 10 UI/ml hCG), en grupos de 10 ovocitos/100 μl. La fecundación se realiza en medio FIV-TALP suplementado con 5 μl de PHE (penicilamina, hipotaurina y epinefrina) por microgota. Para la fecundación in vitro (FIV) se utiliza semen congelado de toro de raza Murciano-Levantina procesado mediante swim-up. En el momento de la fecundación se añaden los espermatozoides capacitados (1x106 esp/ml) y con un máximo de 10 ovocitos/microgota. El cultivo in vitro comienza con la eliminación de las células del cúmulo, tras lo que se depositan los cigotos en microgotas de 30 μl de medio SOF (Synthetic Oviductal Fluid) suplementado con aminoácidos esenciales (BME 50x), aminoácidos no esenciales (MEM 100x) y SBF (5-8 embriones/ microgota). Las placas se mantienen en atmósfera con 5% CO2, 5% O2, 95% de humedad y 38,5ºC durante 7 días. El día 7 de cultivo se realiza una valoración de la calidad de los embriones que van a ser destinados a crioconservación.

Vitrificación de embriones: en este proyecto se utilizó una técnica de crioconservación altamente novedosa y muy difundida para la conservación de embriones en la especie humana. Esta técnica utiliza el dispositivo Cryotop (Kitazato, Fujinomiya, Japón) y las soluciones de vitrificación y desvitrificación definidas por Kuwayama et al. (2005) con el protocolo descrito por Morató et al. (2010). El cryotop está formado por una cinta fina y estrecha (0,4 mm de ancho, 20 mm de largo y 0,1 mm de espesor) unida a un mango rígido de plástico. Durante el almacenamiento, el dispositivo se protege introduciéndolo en un capuchón de plástico sellado por uno de los extremos, que encaja con el mango del cryotop. Tras cargar el dispositivo, éste se introduce rápidamente en nitrógeno líquido y se tapa con el capuchón, que debe haberse sumergido en nitrógeno líquido previamente. El dispositivo completo se almacena, debidamente etiquetado, en tanques de nitrógeno líquido. Para la desvitrificación, se toma el dispositivo cryotop y se retira el capuchón dentro del nitrógeno líquido. Tras pasar al embrión por soluciones de calentamiento, dilución y definitiva, los embriones una vez desvitrificados se disponen individualmente en pajuelas de 0,5 ml en medio PBS con 10% de SBF. Así se transporta en estufa portátil a 38,5ºC hasta la granja donde se encuentran las hembras receptoras.

Sincronización de receptoras y Transferencia de embriones (TE): en una granja comercial se efectuó la selección, inspección y sincronización de un rebaño de novillas lecheras (raza holstein). El protocolo de sincronización incluye la aplicación inicial de una dosis (i.m.) de un análogo de GnRH (Dalmarelin®, Fatro Ibérica, Barcelona, España) luteinizando posibles folículos dominantes y/o preovulatorios que pudieran existir) junto con la inserción de un dispositivo intravaginal liberador de progesterona (CIDR®, Pfizer AH, París, Francia) que queda en el animal durante 12 días. Dos días previos a la retirada del mismo se aplica una dosis de PGF2α (Dinoprost, Dinolytic®, Pfizer, Paris, Francia). El celo se detecta por personal de la granja y en este día se aplica una 2ª dosis de análogo de GnRH. El día de la transferencia son exploradas todas las novillas con celo detectado 6 ó 7 días antes, siendo rechazadas aquellas hembras con CLs de diámetro inferior a 14-18 mm, así como todas las que presenten algún problema uterino. La TE se realiza depositando el embrión en una posición profunda del cuerno ipsilateral al CL, tras la aplicación de anestesia epidural, flunixin meglumine i.m. a dosis de 1,1 mg/kg p.v. (Finadyne®, MSD AH, Boxmeer, Holanda) y 500 mg de hidrocloruro de vetrabutina i.m. (Monzal®, Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Alemania).

Resultados: presentación del caso

Los resultados de la punción que aquí nos atañe, fueron de un total de 36 folículos aspirados entre los dos animales (6 y 30, respectivamente), con una tasa de recuperación (ovocitos/folículos aspirados) del 55% (20/36). De estos ovocitos, 2 fueron de tipo I, 1 de tipo II, 7 de tipo III, y 4 y 3 de tipos IV y V, respectivamente. La tasa de cleavage observada en esta sesión fue de 6/15 (40%), con un resultado final de 2 blastocistos, calidad I, de estos 6 zigotos divididos. Ambos embriones se vitrificaron según la técnica previamente descrita.

El pasado febrero de 2012 se transfirieron los dos embriones vitrificados a dos novillas holstein receptoras (un embrión/receptora). Sólo una de ellas, con un CL de 3,3 cm2 de superficie de tejido luteal, resultó gestante tras la transferencia. El diagnóstico de gestación se efectuó a día 30 post-transferencia, mediante palpación y ecografía transrectal, así como su reconfirmación y seguimiento a 60 días. La gestación fue normal, al igual que el parto y recuperación del neonato. La ternera “Fuensanta” se presentó vital y atenta al nacimiento, pesó 33kg (peso dentro de los rangos fisiológicos de la raza), recibiendo dos tomas de calostro de alta calidad, además de permanecer con su madre durante varios días más. Con el nacimiento de esta ternera, el equipo investigador considera consolidada la estrategia reproductiva planteada para la recuperación y mantenimiento de esta raza. El trabajo continúa y esperamos en breve poder presentar los próximos terneros murciano-levantinos nacidos, frutos de este proyecto.

1. Chaubal SA, Molina JA, Ohlrichs CL, Ferre LB, Faber DC, Bols PEJ, Riesen JW, Tian X, Yang X. Comparison of different transvaginal ovum pick-up protocols to optimise oocyte retrieval and embryo production over a 10-week period in cows. Theriogenology. 65: 1631-48. 2006.
2. FAO. http://www.fao.org/newsroom/es/news/2006/1000464/index.HTML. 2006.
3. Herradón PG, Quintela LA, Becerra JJ, Ruibal S, Fernández M. Fecundación in vitro: alternativa para la mejora genética en bovinos. Arch Latinoam Prod Anim. 15 (supl. 1): 1-8. 2007.
4. Kuwayama M, Vajta G, Kato O, Leibo SP. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reprod Biomed Online. 11: 300-8. 2005.
5. Morató R, Izquierdo D, Paramio MT, Mogas T. Survival and apoptosis rates after vitrification in cryotop devices of in vitro-produced calf and cow blastocysts at different developmental stages. Reprod Fertil Dev. 22: 1141-7. 2010.
6. Oropeza A, Wrenzycki, C, Herrmann D, Hadeler KG, Niemann H. Improvement of the Developmental Capacity of Oocytes from Prepubertal Cattle by Intraovarian Insulin-Like Growth Factor-I Application. Biol Reprod. 70: 1634-43. 2004.

MINECO-INIA (RZ2010-00003-C02-01 y -02). MINECO-FPI (BES-2010-029858). Laboratorios Fatro Ibérica S.L., Calier S.A. y Pfizer AH.