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Discusion creada el 02/06/2008

Protocolo para congelar semen

Hola a todos, soy bioquimico y biotecnologo y estoy interesado en el tema de la inseminación artificial con caballos pero realmente estoy perdido en este tema y me gustaría saber si alguien me puede decir donde puedo encontrar un protocolo para congelar el semen de caballo sin que sufra un choque termico importante. quiero saber que se hace con el semen desde que se extrae del caballo hasta que se produce la inseminación artificial. Lo que me interesa es congelar el semen, no hacer la inseminación con semen fresco. Dispongo de laboratorio con espectrofotometro (medir densidad), glicerol (-80ºC), nitrogeno liquido (-270ºC)...
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Arnoldo Hernandez
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Buckeye, Arizona, Estados Unidos de América
Médico Veterinario Zootecnista
Re: Protocolo para congelar semen
15/05/2010 | No sé si aún le interese, yo sé congelar semen equino.
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Re: Protocolo para congelar semen
09/06/2010 | Don Arnaldo:

Tengo tres preguntas

1. Aproximadamente cuantas pajillas puede dar un caballo saludable por eyaculación.
2. Tanto la extracción de semen como el congelado del mismo se puede hacer en el campo o es necesario estar cerca de una clínica o laboratorio.
3. Cuanto cobra ud por el congelado del semen
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Re: Protocolo para congelar semen
08/11/2011 | estoy interesada en determinar el daño acrosomal de los espermatozoides de caballos. alguien me puede recomendar algún reactivo o tincion que no sea tan costosa y que posteriormente se pueda observar en un microscopio optico. gracias
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Arnoldo Hernandez
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Buckeye, Arizona, Estados Unidos de América
Médico Veterinario Zootecnista
Re: Protocolo para congelar semen
12/11/2011 | Al señor Barbosa, una disculpa por la falta de respuesta a su pregunta, pero no fuí notificado en su momento, pero la respuesta es que el trabajo requiere únicamente de una habitación todo el material utilizado es portátil, lo mas difícil de transportar es la centrífuga por su peso pero la transportamos usualmente. Par quien pregunt sobre la evaluación del daño acrosomal, este puede llevarse a cabo después de tratar el semen con formalina y una tinción que puede ser l tinción de Wright.,
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Re: Protocolo para congelar semen
18/04/2012 | Hola, acerca del numero de pajuelas por extraccion, decir que varia en funcion de cada caballo.
Como orientacion se necesitan 500 millones de espermatozoides viables por mililitro de semen y una dosis inseminante necesitamos medio billon de espermatozoides utiles. Asi que todo depende de la calidad y concentracion espermatica de cada caballo.
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Arnoldo Hernandez
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Buckeye, Arizona, Estados Unidos de América
Médico Veterinario Zootecnista
Re: Protocolo para congelar semen
18/04/2012 | Efectivamente; esa es la dosis inseminante, respecto al número de pajillas, en promedio un garañón produce 40 pajillas por eyaulado, se requieren de 4 por servicio, lo cual alcanzaría para 10 servicios. Desde luego que este número es variable, pero es una producción promedio y muy normal.
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Julio Figueroa
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Ciudad de Guatemala, Alta Verapaz, Guatemala
Médico Veterinario
Re: Protocolo para congelar semen
24/04/2012 | muy buen dia:
alguien fuera tan amable de compartir conmigo algun protocolo de colecta y congelacion de semen?
que equipo es el que se utiliza?
muchas gracias.
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camilo andres ramirez vanegas
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Santiago de Cali, Valle del Cauca, Colombia
Médico Veterinario Zootecnista
Re: Protocolo para congelar semen
27/05/2012 | HOLA A TODOS
DE ACUERDO A LA PREGUNTA QUE SE HACE ARRIBA CREO QUE LA DUDA ESTA DESDE EL MOMENTO DE LA COLECTA HASTA SU RESPECTIVA INSEMINACION EN EL UTERO DE LA YEGUA, PUES BIEN A CONTINUACION DESCRIBIRE TODO EL PROCESO EMPEZANDO DESDE LOS RECURSOS QUE NECESITAMOS.

EQUIPO NECESARIO
VAGINA ARTIFICIAL
BOLSAS DE COLECTA
FILTROS DE COLECTA
TERMOMETRO
GEL LUBRICANTE ESTERIL
TUBOS DE ENSAYO PLASTICOS DE 50 ML
DILUYENTE KENNEY
LAMINAS PORTAOBJETOS Y CUBREOBJETOS
AGUA DESTILADA
TINCION DE NEGROSINA EOSINA O FORMALINA BUFERADA AL 10%
CAMARA DE NEUBAUER
MICROPIPETAS PARA MEDIR 0,05 ML
MACROPIPETAS PARA MEDIR 10 ML
BEACKER DE 100 O 50 ML
CAPILARES
CENTRIFUGA
PLR SE PREPARA KENNY MAS DIMETILFORMAMIDA MAS YEMA DE HUEVO
PAJILLAS DE 0,5 ML
POLVO SELLADOR POLIVINILICO
NITROGENO LIQUIDO
NEVERA DE ICOPOR PEQUEÑA
NEVERA DE ICOPOR GRANDE
HIELO
NITROGENO LIQUIDO
TERMO DE NITROGENO LIQUIDO
COJEPAJILLAS

1. COLECTA DE SEMEN
PARA REALIZAR LA COLECTA DE SEMEN DEBEMOS REALIZAR EL ARMADO DE LA VAGINA ARTIFICIAL CON SU RESPECTIVO TETERO Y FILTRO DE COLECTA YA QUE ESTE NOS AYUDARA A SEPARAR LA FRACCION GELATINOSA DEL SEMEN DE LA FRACCION ESPERMATICA DEL SEMEN, LA VAGINA DEBERA LLENARSE CON AGUA CALIENTE A UNA TEMPERATURA MAS O MENOS DE 58 GRADOS CENTIGRADOS QUE MEDIREMOS CON EL TERMOMETRO, POSTERIOR AL LLENADO DE LA VAGINA QUE PERSONALMENTE RECOMIENDO LA TIPO MISSOURI [NO POR SER MAS BUENA SINO PORQUE ES CON LA QUE MAS HE TRABAJADO[ INSUFLAMOS AIRE POR LA VALVULA TENER EN CUENTA EL TAMAÑO DEL CABALLO QUE VAMOS A COLECTAR YA QUE A MAYOR TAMAÑO OBVIAMENTE MAYOR EL TAMAÑO DEL PENE Y AL MOMENTO DE LA PENETRACION EN LA VAGINA LA PRESION NO PERMITIRA UNA BUENA COLECTA CUANDO TENEMOS LA VAGINA LISTA LE APLICAMOS EL LUBRICANTE Y PROCEDEMOS A IR DONDE ESTA EL CABALLO, SI HAY PHANTOMA EL YA ESTARA FAMILIARIZADO CON EL Y SABRA Q SE VA A COLECTAR, SINO HAY LO QUE SE DEBE HACER ES TOMAR UNA YEGUA EN CELO ASEGURAR SUS MIEMBROS POSTERIORES CON EL FIN DE NO PERMITIR QUE PUEDA AGREDIR AL MACHO CON PATADAS POSTERIORMENTE VAMOS A ACERCAR EL MACHO Y VAMOS A LAVAR EL PENE CON AGUA CALIENTE A 37 GRADOS CENTIGRADOS SIN IR A LASTIMAR DE UNA MANERA MUY SUAVE E IGUAL EL SECADO QUE DEBE HACERSE COLOCANDO UNA TOALLA SECA QUE ABSORVA SIN SOBAR EL PENE. DESPUES QUE HEMOS LAVADO LA PERSONA QUE VA A COLECTAR DEBE ASEGURAR SU SEGURIDAD MEDIANTE EL USO DE CASCO Y BOTAS PUNTA DE ACERO, ES IMPORTANTE ESPERAR QUE EL CABALLO ARME PARA DESPUES PERMITIR SU SUBIDA EN LA YEGUA CUANDO ESTA ARRIBA EL VA A ABRAZAR LA YEGUA Y LA PERSONA QUE COLECTA DEBE COGER EL PENE DE LA BASE Y MANIOBRAR HASTA METER EN LA VAGINA HACIENDO PRESION, SI COLECTO POR EL LADO DERECHO DEBO SUJETAR LA VAGINA CON LA MANO DERECHA Y LA BASE DEL PENE CON LA MANO IZQUIERDA, CUANDO SIENTO PULSACIONES DE LA URETRA EN LA MANO IZQUIERDA EL CABALLO HABRA EYACULADO POCO A POCO BAJO LA VAGINA Y SUAVEMENTE LA RETIRO DEL PENE DEL CABALLO.

2 ADICION DEL DILUYENTE
DESPUES DE TENER EL SEMEN EN LA VAGINA VUELVO RAPIDAMENTE AL SITIO DONDE MONTE MI PEQUEÑO LABORATORIO, QUITO EL TETERO LA BOLSA DE COLECTA Y LA PASO A UN TUBO DE ENSAYO PLASTICO DONDE MEDIRE EL PRIMER DATO IMPORTANTE VOLUMEN QUE CORRESPONDE A LA CANTIDAD EN ML QUE EYACULO EL CABALLO PARA NUESTRO EJEMPLO PONGAMOS QUE NUESTRO CABALLO DIO UN VOLUMEN DE 10 ML EN ESTE MOMENTO PREPARO EL KENNEY A 37 GRADOS Y REALIZO UNA DILUCION QUE PUEDE SER 1:1 O 1:2 DIGAMOS QUE PARA NUESTRO CASO LA VAMOS A HACER 1:1 ES DECIR SI EL VOLUMEN FUE 10 ML APLICAMOS 10 ML DE KENNEY Y LO LLEVAMOS A LA CENTRIFUGA POR 15 MINUTOS A 3000 REVOLUCIONES POR MINUTO

MORFOLOGIA EL OTRO DATO IMPORTANTE QUE VAMOS A TENER QUE OBTENER ES LA MORFOLOGIA COMO SE HACE TOMO UNA GOTA DE SEMEN CON UN CAPILAR GENERALMENTE DE LOS RESIDUOS QUE QUEDARON EN LA BOLSA DE COLECTA LA COLOCO SOBRE UNA LAMINA PORTAOBJETOS LE APLICO UNA GOTA DE EOSINA NEGROSINA O FORMALINA AL 10% ESTAS SUSTANCIAS CAUSARAN LA MUERTE ESPERMATICA POR LO CUAL LO VOY A MEZCLAR BIEN PARA REALIZAR EL EXTENDIDO EN LA LAMINA QUE VOY A DEJAR SECAR PARA LLEVAR AL MICROSCOPIO, UNA VEZ SECA LA LAMINA MONTO EN EL MICROSCOPIO Y CUENTO 100 ESPERMATOZOIDES DE ESOS 100 VOY A MIRAR CUANTOS TIENEN ANORMALIDADES DE CUALQUIER TIPO YA SEA PRIMARIA, SECUNDARIA O TERCIARIA DIGAMOS QUE PARA NUESTRO CASO COMO EJEMPLO TUVIMOS 80 BUENOS Y 20 CON ANORMALIDADES LO QUE QUIERE DECIR QUE TENEMOS UN 80% DE MORFOLOGIA

MIP MOTILIDAD INDIVIDUAL PROGRESIVA DEBEMOS HACERLO RAPIDA LO PODREMOS HACER MIENTRAS SE SECA LA PLACA DE MORFOLOGIA IGUALMENTE DEL SEMEN QUE SOBRO EN LA BOLSITA DE COLECTA TOMO UNA GOTA CON UN CAPILAR COLOCO EN UNA PLACA PORTAOBEJOTOS LE COLOCO UNA PLACA CUBREOBJETOS Y LA LLEVO AL MICROSCOPIO LA VOY A OBSERVAR CON POCA LUZ SINO BAJO LA LUZ VA SER DIFICIL VERLOS EN OCASIONES CUANDO SE TARDA UN POCO LOS ESPERMATOZOIDES BAJAN SU MOTILIDAD ES DECIR SUS MOVIMIENTOS A LO QUE DEBEMOS REALIZAR LA CALEFACION DE LA LAMINA SE PUEDE HACER CON UNA PLANCHA CALENTADORA DONDE COLOCO LA LAMINA Y LA LAMINILLA O SIMPLEMENTE PASANDO RAPIDAMENTE UN ENCENDEDOR CON LLAMA LA MOTILIDAD ES MUY PERSONAL GENERALMENTE CUANDO SE OBSERVA UN BUEN DESPLAZAMIENTO DE LOS ESPERMATOZOIDES CON RAPIDEZ HABLARIAMOS DE UN 80 % CUANDO ES POCO CON MOVIMIENTOS MAS DEBILES POCOS MOVIENDOSE Y MORTALIDAD HABLARIAMOS DE UN 30% EN MI OPINION ESTO ES MUY RELATIVO YA QUE SE DEBEN VER VARIAS COLECTAS PARA TENER UNA IDEA DIGAMOS QUE PARA NUESTRO CASO LA MIP FUE DEL 70 %

CONCENTRACION
LA CONCENTRACION ESPERMATICA POR ML LA VAMOS A HALLAR REALIZANDO UNA DILUCION 1:200 COMO LA HAGO TOMO 0,05 DE SEMEN DE LA BOLSITA DE COLECTA LO DEPOSITO EN UN BEACKER Y DESPUES TOMO 10 ML DE AGUA DESTILADA CON OTRA PIPETA NO RECOMIENDO HACERLO CON JERINGA YA QUE ALGUNAS TRAEN CAUCHO Y ESTO CAUSA MUERTE ESPERMATICA CUANDO YA TENGO LA DILUCION TOMO LA CAMARA DE NEUBAUER Y LA LLENO CON APROXIMADAMENTE 3 GOTAS DE LA DILUCION POR LOS LADOS POSTERIOR A ELLO LA LLEVO AL MICROSCOPIO Y VOY A CONTAR 5 CUADROS DE LA CAMARA QUE POR EJEMPLO NOS VA A DAR 30 EN LOS 5 CUADROS LO CUAL QUIERE DECIR QUE DE ACUERDO A UNAS FORMULAS MATEMATICAS DONDE SE TIENE EN CUENTA LA DILUCION Y LAS DIMENSIONES DE LA CAMRA QUE EL SEMEN EN NUESTRO CASO VA A TENER 300 MILLONES DE ESPERMATOZIODES POR ML

EN ESTE MOMENTO YA TENEMOS 4 DATOS IMPORTANTES Y NECESARIOS PARA CONGELAR
1 VOLUMEN 10 ML
2 MIP 70% (0,7)
3 MORFOLOGIA 80%(0,8)
4 CONCENTRACION 300 MILLONES POR ML

1. CALCULO MILLONES DE ESPERMATOZOIDES EN EL EYACULADO
10ML X 300 MILLONES 3000 MILLONES DE ESPERMATOZOIDES EN EL EYACULADO

2. CALCULO DE ESPERMATOZOIDES FUNCIONALES
3000 X 0,7 X 0,8 1680 millones de espermatozoides funcionales

3. CALCULO DE CANTIDAD DE PAJILLAS QUE PUEDO CONGELAR
1680 DIVIDO 100 16,8 pajillas puedo congelar
lo mínimo que debo empacar por pajilla son 100 millones la dosis inseminante es 500 millones de espermatozoides por yegua lo que quiere decir que por cada yegua debo meter 5 pajillas

4 CALCULO DEL DILUYENTE PLR QUE NECESITO APLICAR PARA CONGELAR
16,8 pajillas x 0,5ml igual a 8,4ml DE PRL
0,5 corresponde al tamaño de la pajilla que voy a congelar

estos cálculos nos dan el valor de prl que necesitamos para congelar es decir el segundo diluyente

3. PREPARANDO PARA CONGELAR

POSTERIOR A QUE TERMINO LA CENTRIFUGA SACAMOS LOS TUBOS Y EXTRAEMOS EL SOBRENADANTE. VA A QUEDAR EN EL TUBO UN MATERIAL CAFE QUE LLAMAMOS EL PELET EL DEBE SER MEZCLADO SUAVEMENTE HASTA SER HOMOGENEO COMO YA SABEMOS CUANTAS PAJILLAS PUEDO EMPACAR Q SON 16,8 APROXIMADAMENTE 17 SACO 17 PAJILLAS DE 0,5 ML Y LAS MARCO EXISTEN EQUIPOS DE MARCACION O SIMPLEMENTE CON UN MARCADOR DONDE LLEVARA LA FECHA Y EL NOMBRE DEL CABALLO. POSTERIOR A ELLO AGREGO AL PELLET ES DECIR LA FRACCION RICA EN ESPERMATOZOIDES DESPUES DEL CENTRIFUGADO EL PLR QUE YA CONOCEMOS EL VALOR 8,4 ML Y EMPIEZO A EMPACAR LAS PAJILLAS DE A 0,5 ML LAS CUALES VAN A CONTENER DE A 100 MILLONES DE ESPERMATOZOIDES LAS PUEDO SELLAR DE DOS FORMAS CON UNA SELLADORA PLASTICA O CON POLIVINIL EN POLVO DESPUES DE CARGADA CONTACTO CON EL POLVO Y CONTACTO CON AGUA ESTO SELLARA LA PAJILLA.
CUANDO LAS TENGO LISTAS EN NUESTRO EJEMPLO LAS 17 PAJILLAS TOMO LA NEVERA GRANDE Y COLOCO EL NITROGENO LIQUIDO MAS O MENOS 2 CENTIMETROS DE ALTURA A ELLO MIDO 7 CM DE ALTURA CON REFERENCIA AL NIVEL DEL NITROGENO LIQUIDO Y LAS VOY UBICANDO ALLI SIN PERMITIR QUE CAIGAN AL FONDO ELLAS ESTARAN POR 10 MINUTOS EXPUESTAS A LOS VAPORES DE NITROGENO TOTALMENTE TAPADAS. POSTERIOR A ESTO SE DEPOSITAN EN EL FONDO DE LA NEVERA DE ICOPOR LA CUAL YA MENCIONAMOS TIENE UN NIVEL DE 2CM DE ALTURA DONDE SE DEJARAN POR 10 MINUTOS PARA PROCEDER A SACAR HAY MISMO LO MAS CERCA POSIBLE AL NITROGENO Y RAPIDO METER EN LAS CANASTILLAS Y PASARLAS RAPIDAMENTE AL TERMO DE CONGELACION.

QUE DEBEMOS HACER YA CUANDO LAS TENEMOS CONGELADAS EVALUAR SI NUESTRO TRABAJO ESTUVO BIEN COMO CONGELAMOS 16.8 ES DECIR 17 UNA NOS QUEDO CON UNA DOSIS SEMINAL MAS BAJA ESA PAJILLA LA DESCONGELAMOS EN AGUA CALIENTE A 37 GRADOS POR 30 SEGUNDOS LA MONTAMOS EN UNA PLACA Y EVALUAMOS LA MOTILIDAD Y LA SUPERVIVENCIA DE LOS ESPERMATOZOIDES

CABE ANOTAR QUE LO QUE ACABO DE CITAR ACA ES PRODUCTO DE MI EXPERIENCIA SI DE PRONTO HAY COSAS QUE NO COMPARTEN ESTARA BIEN CADA UNO HACE SU TRABAJO DE ACUERDO A LO QUE CONOCE Y SABE APLICAR

EN CUANTO A LAS PREGUNTAS ANTES HECHAS EL DR HERNANDEZ YA RESPONDIO A ALGUNAS ASI Q VOY A RESPONDER LAS Q CREO NO HAN SIDO SOLUCIONADAS EN SU TOTALIDAD

CUANTAS PAJILLAS DA UN CABALLO
DEPENDE DE LA RAZA DE LAS VECES QUE HALLA SIDO COLECTADO, SI ES LA PRIMERA VEZ QUE ES COLECTADO EN PAISES DE ESTACIONES HAY UN AUMENTO EN LA CONCENTRACION ESPERMATICA EN PRIMAVERA ESTA DEMOSTRADO. ENTONCES NO ME ARRIESGARIA A DAR UNA CIFRA EXACTA PORQUE REALMENTE ES MUY RELATIVO TODOS LOS ANIMALES ASI COMO NOSOTROS LAS PERSONAS SOMOS UNIVERSOS TOTALMENTE DIFERENTES RECUERDEN QUE LA BIOLOGIA AL CONTRARIO DE LA MATEMATICA NO ES UNA CIENCIA EXACTA

LA CONGELACION SE PUEDE HACER EL CAMPO LO QUE HABRIA QUE HACER ES MONTAR UN PEQUEÑO LABORATORIO CERCA DONDE SE VA A COLECTAR

ESPERO CON MI INTERVENCION HABER SOLUCIONADO LAS DUDAS CUALQUIER COSA ESTARE ATENTO A SUS COMENTARIOS GRACIAS CAMILO RAMIREZ


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Re: Protocolo para congelar semen
21/06/2012 | DOCTOR CAMILO ANDRES, ACA EN COLOMBIA- BOGOTA DONDE PUEDO CONSEGUIR EL COLORANTE EOSINA NIGROSINA? MUCHAS GRACIAS
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camilo andres ramirez vanegas
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Santiago de Cali, Valle del Cauca, Colombia
Médico Veterinario Zootecnista
Re: Protocolo para congelar semen
26/06/2012 | HOLA NATALY EL COLORANTE LO PUEDES CONSEGUIR EN CASAS COMERCIALES DONDE VENDAN DISPOSITIVOS E INSUMOS PARA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN BOGOTA EN CEBA O AGROCAMPO O MAS A LA FIJA EN IMPLEGAN.
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