Resumen

Si los beneficios potenciales de los probioticos para acuacultura, especialmente en manejo de enfermedades y mejora del desempeño son mas y mas documentados, sin embargo la precisa cuantificación y validación de estos beneficios a nivel granja, debido a muchas limitaciones técnicas .En este estudio , llevado a cabo en camarones L. vannamei en México evaluamos 2 diferentes cepas probioticas (bacterias acido lácticas Bactocell^® y levadura viva Levucell^® SB) en condiciones de granja comercial , utilizando un método previamente descrito y validado in situ, método designado para superar las variabilidades entre estanque y estanque y para optimizar el poder estadístico de la prueba : cajas flotantes en los estanques .

Primero que nada, a pesar de que la prueba demostró condiciones optimas de crecimiento (sin retos), los 2 probioticos fueron capaces de mejorar la capacidad de sobrevivencia (+10%. P<0.05 y + 9.5% P= 0.11, con Bactocell^® and Levucell^® SB, respectivamente) y el índice de conversión alimenticia. Como resultado los costos de alimentación fueron reducidos significativamente   : -11.4% and - 12.8%, con Bactocell^®  y  Levucell^® SB, respectivamente. El efecto de los probioticos en los camarones en tasa de crecimiento no fuera estadísticamente detectable, sin embargo la diferencia en el  rango de conversión alimenticia (FCR) entre los 2 probioticos. Verdaderamente, no solo la mejora en el índice de sobrevivencia podría explicar el efecto de Levucell^® SB  en la mejora de la conversión alimenticia (FCR) ya que fue superior al efecto observado con Bactocell^®, llevando a la hipótesis que la utilización de alimento puede ser mejorada con el uso del  probiotico de levadura. Estudios posteriores deberán definir el mecanismo de acción y los efectos de esta levadura viva en la salud y en la resistencia a enfermedades  en camarones del genero penaied.

En conjunto, esta prueba in situ indican que ambos  Bactocell^® and Levucell^® SB aparecen como herramientas valiosas para optimizar el desempeño  de los camarones y el ingreso sobre los costos de aun bajo condiciones optimas de producción en México.

Introducción

Mientras que la aplicación comercial de probioticos están aun en estepas tempranas en Europa, es ya  una realidad  practica  y comercial en muchos países productores Acuícolas en Asia y América  Central y del Sur .El uso de probioticos en acuacultura ha sido originalmente desarrollado con la idea de alcanzar un mejor manejo de enfermedades y ha sido ahora implementado de forma creciente como parte de las ´Mejores prácticas de manejo ", particularmente en sistemas de cultivo de camarón.

Es interesante como además del manejo de la enfermedad, los probioticos también, a través de su modo holístico de acción, contribuir a optimizar  el desempeño de los animales acuáticos  y ayudar en enfrentar algunos de los retos enfrentados por las industrias acuícola y de alimentos balanceados, intensivos y semi  extensivos.

En el caso de especies de crustáceos, el desarrollo del concepto de probiotico fue primero conducido por acercamientos prácticos y empíricos, después a través de  los últimos 10 a 15 años estudios científicos y reportes de campo en este tópico han proveído los fundamentos y ensenado los beneficios que los probioticos pueden alcanzar en  producción de camarón en granja, haciendo de este concepto una práctica bien aceptada a través de los profesionales de este sector.

Sin embargo uno puede argumentar que muchos de los estudios de probioticos son conducidos en unidades experimentales a  pequeña escala  bajo condiciones de laboratorio. Por  ejemplo, nuestra revisión de la literatura  resalta que más del 70% de los estudios de uso de probioticos en camarón fueron desarrollados en condiciones  de laboratorio, y el resto en incubadoras o criaderos comerciales  o bajo condiciones de estanque .Por lo mismo a pesar de que algunas de las prioridades más altas el día de hoy son las de entender el modo de acción de los probioticos en crustáceos y el mejorar la regulación sobre su uso , aparece obvio que la eficiencia de los probioticos a escala  comercial requiere  validaciones "in situ", idealmente en estanques , para resaltar el valor real  para al productor .

Sin embargo no es una tarea fácil y las personas que han trabajado en la evaluación de aditivos para alimentos balanceados en estanques a nivel de granja ahora que mucho trabajo se ha hecho y es altamente complejo debido a muchas limitaciones logísticas ,económicas y de /o experimentales .Las más obvias limitaciones fueron resumidas en nuestro estudio previo ( Chim et al., 2008): (i) producción de alto número de post -larvas (PL) viniendo del mismo lote ,que debían de  ser sembradas al mismo tiempo en todos los estanques sujetos a experimentación ,(ii) cálculo  de la tasa final de sobrevivencia afectada por posible sub o sobre estimación , particularmente con respecto al número de PL sembradas y subsecuentemente  animales cosechados (iii) el suministro  de alimentos experimentales a nivel y escala industrial  y (iv)  la alta variabilidad dentro del estanque de las respuestas zootécnicas , derivando inter alia  de diferencias en características de los estanques , el origen y la calidad de la post larva, y manejo de gestión. Para ilustrar este último punto es verdaderamente frecuente, para un productor semi extensivo, el observar  grandes diferencias  en el índice de sobrevivencia final entre estanques de la misma  granja, mientras no hubo tratamientos específicos aplicados. La variabilidad entre granjas entre estanques hace difícil el uso como unidades experimentales .Como resultado ,muchos de los experimentos  con probioticos llevados a cabo en estanques de cultivo de camarón  quedan inconclusos  por un débil poder estadístico  bajo el  umbral comúnmente aceptado  del 80 % (Cohen,1988) El poder estadístico significa la capacidad de un experimento para detectar diferencias reales , si existen , al nivel deseado de significado.

Para comparar tratamientos y para determinar precisamente si el probiotico en la ración dietario tiene un efecto o no , es por ello esencial estandarizar estas variables tanto como sea posible para cada estanque e idealmente el realizar un número adecuado de replicas . En verdad una muestra muy pequeña va a llevar muy seguido a dificultades de interpretación, resultados engañosos e inevitablemente a conclusiones temerarias. Para evitar este problema propusimos  y demostramos que el uso de cajas flotantes en estanques de cultivo de camarón es una herramienta sensiblemente experimental, económica, estadísticamente poderosa, particularmente adaptada para apreciar probioticos, (Chim et al., 2008; Castex et al., 2008). Además, las pruebas en cajas flotantes son ciertamente más representativas de las condiciones del estanque que las pruebas de Laboratorio en agua clara  y por lo mismo ofrecen una buena exposición (compromiso) Esta herramienta es usada actualmente por muchas compañías  de alimentos balanceados para evaluar diferentes materias primas o aditivos alimenticios.

En el presente estudio Malta Cleyton y Lallemand Nutrición Animal evaluaron el efecto de 2 probioticos en la dieta, el producto  Bactocell^® (Pediococcus acidilactici MA18/5M) and Levucell^® SB (Saccharomyces cerevisiae boulardii CNCM I-1079), en camarón (Litopenaeus vannamei ) suministrado bajo condiciones comerciales en una granja en el  Noroeste de México( Sestado de Sinaloa) usando un diseño de cajas flotantes . Como hemos previamente ensenado la habilidad de estos productos para apoyar la salud de los camarones en condiciones de reto (Castex, 2009). El principal objetivo de esta prueba fue el ensenar si podíamos detector el efecto de las 2 formulaciones de probioticos en el desempeño de camarón blanco bajo condiciones de producción semi intensivas.

MATERIALES Y METODOS

El Estudio tuvo lugar en una granja al Noroeste de México ( estado de Sinaloa ) usando un diseño de cajas flotantes instalado en uno de los estanques de tierra de la granja (foto # 1 ) .La prueba fue conducida bajo la supervisión del departamento técnico  de Malta Cleyton .El sistema de  cajas flotantes fue previamente validado en la granja para desarrollo de camarón blanco de la fase de post larva hasta cosecha .Típicamente el sistema fue calibrado a crecimiento de camarón  L. vannamei de 3g a arriba de  14g a  una densidad de  25 animales/m².

Figura 1. Izquierda: Diseno de jaulas flotantes  y usado durante el experimento  (granja al Noroeste de México (Estado de Sinaloa) ).Derecha : charola de alimentación /2 charolas de alimentación fueron instaladas por jaula /

Un Total de cuatro  cajas por tratamiento (3x4=12 jaulas, usando 2 pontones) fueron utilizadas en este experimento. Sin embargo, Chim et al (2008) encontraron bajo sus condiciones que por una diferencia  esperada del 20 % de la media del grupo control, 3 a 6 jaulas flotantes por tratamiento serian razonables para determinar diferencias estadísticas para parámetros de crecimiento y índice de sobrevivencia, respectivamente. En el presente caso , un análisis a priori  se llevo acao ll con  datos de experimentos anteriores llevados a cabo en México , con el mismo diseño de revelo una mejor sensibilidad del sistema .De hecho , basados en los coeficientes de variación medidos entre las cajas , encontramos que 4 replicas por tratamiento serian adaptadas para detectar un efecto de probiotico de mínimo del 10 % , 13 , y 6 % respectivamente para el índice de sobrevivencia, el índice de conversión alimenticia (FCR) y el peso corporal final comparado con el control con un error tipo 1 de probabilidad  (α) del 5% y de poder estadístico del 80%.

225 camarones con un promedio de ganancia corporal inicial de 3.3 g±0.1 (SD) y originándose desde el mismo estanque donde fueron mantenidos en cada jaula (estas con dimensiones de 3 x 3 metros)  para alcanzar la densidad de 25 piezas /m². Después del traspaso los camarones fueron aclimatados por 2 días y alimentados una dieta comercial (Api -Camarón, Maltacleyton) por 2 semanas (Tabla 2) . Del día 3 en adelante, los camarones fueron alimentados con sus dietas respectivas por un period de 59 días hasta un  peso final corporal promedio de  17.4g±0.5 (SD). Tres grupos fueron considerados: dieta Control + Bactocell^® (5.10⁶ CFU/g o 0.5g/kg), dieta Control  + Levucell^® SB (8.10⁶ CFU/g o 400g/ton). Para los grupos tratados, los probioticos (forma seca en polvo) fueron añadidos sobre el pellet y el alimento y  el mismo  fue almacenado en la granja a temperatura ambiente  hasta su uso.

Los  camarones fueron alimentados solo en charolas de alimentación (2 charolas por jaulas: 70 cm x 70 cm bancos de ostiones) en orden para ser capaces para estimular consumo. Tres raciones por día fueron aplicadas a las  8:00 am, 1:00pm and 5:00pm. El rango de alimentación fue ajustado cada día para cada jaula de acuerdo al alimento remanente en las charolas después de las los periodos de alimentación. EL suministro de alimentación fue calculado como un porcentaje de la biomasa y del peso promedio corporal por jaula que fue estimado cada semana  (con una precisión de f 0.1g). Los siguientes parámetros fueron por ello determinados  cada semana y al final de la  prueba para el periodo  completo de la prueba; tasa semanal de crecimiento y tasa promedio de crecimiento, sobrevivencia, biomasa producida, y rango de conversión alimenticia aparente (FCR= cantidad de alimento suministrado/ganancia de biomasa húmeda  del camarón) .

Resultados de los grupos con probioticos fueron comparados al control usando pruebas no paramétricas y un análisis  de poder  Post hoc fueron usados para ser aprecio a posteriori las estadísticas de poder basados en un diseño completamente al azar con 2 tratamientos usando un uno tailes t test de significancia.

Adicionalmente , los siguientes parámetros fisicoquímicos del agua fueron determinados diariamente ( mañana y tarde) con la intención de evaluar la calidad de las condiciones medioambientales: Temperatura, Oxigeno, salinidad y turbidez , el PH fue también monitoreado 2 veces por semana ..

Resultados y Discusión

Condiciones de rendimiento durante el curso del experimento fueron consideradas como optimas para L. vannamei, también todos los parámetros fisicoquímicos monitoreados durante el período de la prueba fueron considerados como buenos .La temperatura fluctuó con valores mínimos de 24.2°C en la mañana y máximos 33.8°C en la tarde .En el caso de salinidad, los valores estuvieron entre los rangos de 34 % a 39%, mientras la turbidez fluctuó entre 50 y 85 cm. El pH siempre se mantuvo constante en rangos entre 8 y 8.9  considerados como rangos aceptados para L. vannamei.los valores  de oxigeno fueron también aceptables  (2-5ppm en la mañana y  8-10ppm en la tarde ), excepto por 2 días durante la última semana del experimento , valores mínimos de 1.6 ppm  fueron registrados en la mañana .Estos niveles bajos de oxigeno fueron también registrados en las mismas fechas en otros estanques y en cualquier caso nunca asociados a signos de morbilidad .También fue considerado el no haber afectado el resultado de la prueba como ocurrió solo 2 días antes de la cosecha .

Bajo las  condiciones de la prueba, el  desempeño de crecimiento completo fue muy bueno en todos los grupos con un peso promedio corporal final  de 17.4g±0.5 (SD)  para un rango de crecimiento semanal  promedio de  0.24g/día. Este resultado confirma pruebas previas conducidas en la misma granja y valida una vez más el sistema de jaulas flotantes para apreciar diferentes regímenes alimenticios bajo condiciones comerciales.

 El muestreo semanal demostró que los camarones exhibieron crecimiento muy similar sin importar el tratamiento, sin embargo al final del periodo de cultivo los  pesos finales promedio de los camarones fueron ligeramente más altos en el grupo usando  Bactocell^®  (Tabla 3).Es importante el enfatizar que bajo condiciones de esta prueba (tipo de alimento utilizado , condiciones medioambientales optimas, densidad adecuada y ausencia de estrés particular ) el efecto de los productos  probioticos en el crecimiento, si existe , fue demasiado bajo para ser detectado. Desde un punto de vista práctico  está claro que bajo estas condiciones, el efecto detectado puede ser reconocido como despreciable.

El índice de sobrevivencia en el grupo control fue aceptable, alcanzando 73.8% al final .Interesantemente el grupo  Bactocell^®  tuvo una mucho mayor tasa de crecimiento comparada con el control (+10%, P<0.05; poder estadístico de  80%; Tabla 3)  mientras el grupo  Levucell^® SB demostró similar tendencia aun cuando los resultados no fueron significativamente diferentes del control (p=0.11). Este efecto de  Bactocell^®  en en el índice de sobrevivencia  de camarones del genero penaeid ha sido  documentada  con anterioridad  en varias especies de camarón .(P. monodon, L. vannamei, L. stylirostris) bajo diferentes condiciones y fue por ello esperado .El modo de acción de este probiotico en camarones penaeid ha sido documentado y se apoya en una modulación de la flora intestinal asociado a una prevención del estrés oxidativo dando como resultando en una mejor estado de  salud de los animales  (Castex, 2009). La mejora en la sobrevivencia es medida en la presente prueba resulto en un mejoramiento de la biomasa final del 11% y el 8% comparado con el control respectivamente para  Bactocell^®  y  Levucell^® SB. Esos resultados fueron asociados a una mejora significativa  en el índice de conversión alimenticia FCR en ambos grupos probioticos comparados contra el control  (p<0.05; poder estadístico >80%). Esto es muchas veces esperado ya que por cálculo una mayora tasa de sobrevivencia con un desempeño similar en crecimiento  resulta en una menor conversión alimenticia (FCR). También calculamos de los productos en el costo relativo de producción (costo de alimentación) comparados al grupo control.(Tabla 4). Confirmamos aquí que los beneficios desplegados  por los 2 probioticos dirigen hacia una significativa reducción en el costo de alimentación a nivel de granja  (-12% en promedio). Esto es un resultado importante especialmente si consideramos que el alimento representa cerca del 60 % al 70 % del costo de producción y de de la reducción en el costo de producción es una de las mayores situaciones actualmente, solo después de las enfermedades, de acuerdo a una reciente encuesta en cultivo de camarón llevada a cabo por el  Global Outlook for Aquaculture Leadership (Valderrama & Anderson, 2011). Si consideramos la mejora al nivel de granja, basada en el desempeño alcanzado por la granja en un ciclo en 2011 (110 toneladas métricas de camarón producido), el uso de los 2 probioticos resultaría en una deducción del costo de producción de más de 155 000 pesos para el productor para el mismo volumen de producción.

Finalmente, no se registro diferencia estadística entre los 2 grupos probioticos para alguno de los parámetros medidos .Esto sugiere que bajo esas circunstancias, i.e.en la ausencia de algún reto, no fuimos capaces de detectar una clara diferencia en el tipo de efecto desplegado por los probioticos a pesar de que el modo de acción de una levadura viva  y una bacteria viva acido láctica tienden a ser muy distintos. Es interesante el notar sin embargo que en el caso de LSB la mejora del índice de conversión alimenticia (FCR)  el efecto fue más pronunciado que con Bactocell^®, sugiriendo un efecto posible en la utilización alimenticia. Esta observación ha sido investigada más a fondo a nivel laboratorio ya que un experimento previo  en tanques con agua clara ha demostrado que  Levucell^® SB fue capaz de mejorar significativamente la conversión alimenticia y el crecimiento de camarones del genero penaeid (data no publicados). 

Finalmente vale la pena  mencionar que como parte de un segundo objetivo del estudio (datos no ensenado aquí) un cuarto tratamiento del estudio fue también considerado  para evaluar el efecto de la levadura  Levucell^® SB  al ser alimentados bajo una forma inactiva (inactivación  de la levadura  por calor) Interesantemente los resultados demuestran que la levadura viva Levucell^® SB debe estar viva para demostrar sus efectos.

Conclusión

Sobre todo las pruebas de poder  post Hoc aplicadas en los datos confirmaron que nuestro  diseño experimental estuvo bien adaptado para detector el efecto del  probiotico en desempeño zootécnico. Confirmamos en este caso la capacidad de  Bactocell^® para mejorar el índice de sobrevivencia del camarón en condiciones óptimas de producción en México, resultando en beneficios económicos para los productores. Este resultado soporta mas allá el efecto como  promotor de la salud  del   Pedicococcus acidilactici MA18/5M en las especias acuáticas y demuestra además de conferir una ´seguro "para el productor en caso de  que un evento de riesgo ocurra, Bactocell^®  puede contribuir a optimizar el desempeño técnico y económico  bajo condiciones optimas de producción.  

Los resultados en relación a la levadura viva Levucell^® SB revelan un efecto  interesante en la utilización de alimento a pesar de que no podemos concluir en su efecto en índice de sobrevivencia ya que el tamaño de la muestra   (n=4) usado en este experimento no permitió detectarlo.

Estudios posteriores deberán de entregar el mecanismo de acción involucrado  y los efectos de esta levadura viva en la salud y en la resistencia a enfermedades en camarones del genero penaeid.

Sin Embargo los 2 productos probados han demostrado ser herramientas para optimizar el desempeño  e ingresos sobre costos de alimentación bajo condiciones de producción en granjas de México.

Referencia Bibliográfica 

Castex, M., Chim, L., Pham, D., Lemaire, P., Wabete, N., Nicolas, J.-L., Schmidely, Ph. & Mariojouls, C. (2008) Probiotic P. acidilactici application in shrimp Litopenaeus stylirostris culture subject to vibriosis in New Caledonia. Aquaculture 275, 182-193

Chim, L., Castex, M., Pham, D., Brun, P., Lemaire, P., Wabete, N., Schmidely, P. & Mariojouls, C. (2009) Evaluation of floating cages as an experimental tool for marine shrimp culture studies under practical earthen pond conditions. Aquaculture 279, 63-69.

Cohen, J., 1988. Statistical Power Analysis for the Behavioral Sciences. 2nd ed. Lawrence Erlbaum associates, Inc., Hillsdale, NJ.

alderrama, D. & Anderson, J.L. (2011). Shrimp production survey. GOAL 2011, Santiago, Chile.