Name: Diagnóstico e Identificación de serotipos de Salmonella: importancia de un buen muestreo
Uploaded: 2016-12-12T00:00:00-03:00
Description: Martha Pulido Landínez, MV, MSc, PhD, DACPV, Profesora Clínica Asociada, brindó la conferencia: "Diagnóstico e Identificación de serotipos de Salmonella a partir de muestras de avicultura: importancia en un buen muestreo" en el Congreso de Avicultura Centroamericano y del Caribe 2016 auspiciada por Vetanco.

1. Introducción

El diagnóstico busca revelar la presencia del (los) agentes causantes de una enfermedad a partir de la observación y el análisis. Así, en el contexto general de la prevención y el control de enfermedades, un buen diagnóstico es la base para lograr programas exitosos de control.

Algunas bacterias del género Salmonella pueden causar enfermedades graves en las aves como tifoidea aviar y pulorosis; con manifestación clínica severa. Estas entidades son causadas por serotipos específicos, altamente adaptados a las aves. O en otras ocasiones la presencia de esta bacteria en las aves puede pasar desapercibida, sin causar sintomatología; como en el caso de las infecciones con salmonelas paratifoideas. Sin embargo, dependiendo de las condiciones de manejo (alta densidad, inmunodepresión, etc.), estas salmonelas también pueden producir cuadros clínicos severos y alta mortalidad.

En el contexto de salud pública la salmonelosis está muy ligada a los productos avícolas (principalmente la carne de pollo y los huevos), no solamente porque son considerados como la fuente más común de esta bacteria; sino porque en la presentación de la enfermedad influyen diferentes factores que se relacionan con hábitos alimenticios y manejo de estos productos por parte del consumidor como son la manipulación inadecuada del producto, manejo deficiente de la cadena de frio, consumo de productos mal cocidos; entre otros. Así cuando se habla de la prevención y el control de la salmonelosis se deben contemplar conceptos integrales que deben basarse en un diagnóstico adecuado, no solo de los serotipos causantes del problema, sino también de la identificación de los factores de riesgo y de persistencia, principalmente a nivel de la producción avícola primaria.

2. Salmonella en la Cadena Avícola

El monitoreo constante de la situación en las producción primaria (granjas, plantas de incubación, plantas de proceso, etc), se hace necesario para poder sugerir medidas de intervención específicas. Teniendo en cuenta que la cadena de producción de pollo o de huevo en la mayoría de los casos está totalmente integrada, se hace necesario establecer medidas de control en cada uno de sus eslabones.

Adicionalmente un monitoreo constante de la situación en las granjas puede llevar a una disminución de los niveles de Salmonella en el producto final, concepto que ha sido base para la formulación de los programas “De la granja al tenedor”, que buscan la disminución de ésta y otras bacterias que producen enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs); bajo la premisa de controlar el problema desde el productor primario. Por la importancia de la asociación de Salmonella con los alimentos de origen aviar, el conocimiento de la compleja epidemiologia del agente se hace necesario para lograr eficacia en el control.

Esto sólo se puede lograr mediante el monitoreo constante realizado bajo condiciones específicas. Sin embargo, debido a la gran variedad de serotipos que pueden estar involucrados en la enfermedad, así como por las múltiples fuentes de infección existentes, la erradicación de salmonela en las explotaciones de aves puede ser un objetivo difícil de alcanzar. Se requiere de un trabajo intenso para llegar a eliminar al menos los serotipos que específicamente pueden estar involucrados como causantes de enfermedades alimentarias o que produzcan enfermedades específicas en las aves.

En síntesis, la contaminación por Salmonella puede producirse en cualquier etapa de la cadena de producción avícola, a partir de diversas fuentes (materias primas para alimentación animal, fabricación de alimento, incubadoras, granjas de producción, hasta el producto y subproductos de origen avícola, entre otros). Por tanto, un plan de control requiere de vigilancia constante en cada uno de los eslabones de la cadena productiva.

3. Diversidad de Salmonella: un reto adicional para el diagnóstico

El género Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae. La clasificación reconocida actualmente incluye dos especies: Salmonella enterica (con seis subespecies) y Salmonella bongori. En al año 2007 el Instituto Pasteur describió 2.557 serotipos a través del esquema Kauffmann-White-Le Minor (KWL) para caracterizar los diferentes serotipos del género con base en sus fórmulas antigénicas (Grimont y Weil, 2007). En el 2010 el suplemento 47 (2003 – 2007) de ese instituto informó de la caracterización de 70 serotipos más para completar 2649 (Guibourdenche et al; 2010). De más de 2600 serotipos identificados hasta 2010, tal vez sólo 100 serotipos de la subespecie enterica producen enfermedades en un número limitado de especies.

El hábitat natural de salmonelas de la subespecie enterica puede ser dividido en tres categorías con base en la especificidad del huésped y el patrón clínico:

Categoría 1: Altamente adaptadas al hombre incluyendo S. Typhi y S. Paratyphi A, B y C, agentes de la fiebre entérica;
Categoría 2: Altamente adaptadas a los animales como S. Dublin (bovinos), S. Choleraesuis, S. Typhisuis (porcinos), S. Gallinarum y S. Pullorum, causantes de la tifoidea aviar y la pulorosis, respectivamente.
Categoría 3: se incluyen la mayoría de los serotipos que afectan al hombre y a los animales, denominadas Salmonelas zoonóticas o paratífoideas, responsables por las enfermedades de transmisión por los alimentos, que son de distribución mundial.

Las salmonelas paratifoideas, por lo general no producen enfermedad epidémica con manifestación clínica en aves inmunológicamente maduras. S. Typhimurium, S. Enteritidis y S. Heidelberg (tres serotipos de gran importancia relacionados con la producción de ETAs), son de baja virulencia excepto en aves jóvenes o sujetas a estrés. En algunos casos estas variedades producen infección sistémica, lo que resulta en la transmisión vertical donde la contaminación ambiental puede ser de difícil control. Estos serotipos tienen la habilidad de colonizar el tracto gastrointestinal de diferentes especies animales e introducirse en la cadena de producción incrementando el número de casos de salmonelosis por infección alimentaria en humanos.

4. Importancia del muestreo para un diagnóstico exitoso:

Un buen programa de monitoreo de Salmonella busca explicar por qué, para qué, cuándo, cómo y qué evaluar; en la base de que el conocimiento del estado sanitario de una explotación, específicamente relacionado con Salmonella, permitirá la formulación de programas de bioseguridad y planes vacunales adecuados, además de la toma de decisiones a tiempo en el manejo de las aves. También buscará contribuir en la implementación de una metodología de evaluación constante de los programas de bioseguridad y planes vacunales instaurados para el control de la salmonelosis. De igual manera aportará elementos de juicio para la evaluación de las medidas de manejo y control instauradas en los casos de lotes positivos.

Muchos países afectados por el marcado aumento de los casos de salmonelosis tanto en seres humanos como en las aves están trabajando en estrategias de control basados en diferentes enfoques de identificación y monitoreo de la infección durante toda la cadena de producción. Los esquemas estratégicos están basados en directrices de diferentes organizaciones (Unión Europea, Oficina internacional de Epizootias, Código Internacional de Salud Animal, entre otras).
Sin embargo, cada país requiere de estudios específicos que consideren cada una de las particularidades propias de la región o la forma de manejo de las aves, que permita identificar las debilidades propias a fin de crear medidas de control adecuadas para cada situación.

Un elemento clave en el diagnóstico es la implementación de técnicas de identificación rápidas y confiables; así el conocimiento de los diferentes serotipos involucrados en las explotaciones avícolas de un país, así como las diferentes fuentes y orígenes de la bacteria permitirán formular estrategias que contemplen acciones preventivas, así como evitar o minimizar los factores de riesgo, la toma de decisiones adecuadas para el control o la erradicación de las enfermedades causadas por Salmonella y en el caso que sea útil, la instauración de tratamientos exitosos.

Los programas de control de Salmonella en la industria avícola deben iniciarse a nivel de las abuelas y las granjas de reproductoras. Todos los esfuerzos de eliminación de esta bacteria deben enfocarse en primera instancia en el control de estos renglones con el fin de obtener carne de ´pollo y huevos libres de Salmonella.

Todo programa exitoso comienza con el establecimiento de un buen esquema de monitoreo, estableciendo puntos críticos en todo el proceso de producción. Sin embargo todo programa que se quiera instaurar deberá contemplar un plan de muestreo racional, que sea sostenible tanto en tipo de muestras, número de muestras y especialmente en frecuencia de muestreo.

Tabla 1: Tipo de muestras a colectar dependiendo del sector avícola a evaluar

Diagnóstico e Identificación de serotipos de Salmonella a partir de muestras de avicultura: importancia de un buen muestreo. - Image 1

5. Procesamiento de las muestras - Bacteriología tradicional y asignación de serotipo:

La especie Salmonella enterica subespecie enterica incluye bacilos Gram negativos. La mayoría de éstos, por la presencia de flagelos perítricos, muestran motilidad con excepción de S. Gallinarum, S. Pullorum y algunas variedades específicas de S. Typhimurium.

Existen diversos métodos para el aislamiento e identificación de Salmonella. Muchos de los procesos a seguir se basan en recomendaciones de organismos oficiales de control. En el esquema 1 se presentan algunos ejemplos.

Como todas las bacterias, Salmonella depende de su metabolismo para sobrevivir. Así, la trasformación selectiva de nutrientes del medio externo (Ej. Azucares) es la base de la identificación bioquímica de este microorganismo.

Por lo general Salmonella no fermenta la lactosa, es ureasa negativa, fermenta la glucosa con producción de ácido y gas (excepto S. Typhi). También fermentan L-arabinosa, maltosa, D-manitol, Dmanosa, L-ramnosa, D-sorbitol, trehalosa, D-xilosa y D-dulcita. Es oxidasa negativo, catalasa positivo, Indol y voges - Proukauer (VP) negativo, rojo de metilo y citrato de Simmons positivo. Producen H2S (color negro de las colonias), reducen nitratos a nitritos y no desaminan la fenilalanina. La información sobre reacciones bioquímicas dependiendo de la especie y la subespecie de Salmonella se muestra en la tabla 2.

Tabla 2: Clasificación de Salmonella spp. de acuerdo con sus propiedades bioquímicas

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^{Tomado de: Mantilla, Pulido y Jaime, 2009. Valoración de la situación actual de explotaciones de ponedoras comerciales con cuadros compatibles con tifoidea aviar en Colombia.}

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Asignación de serotipo: serotipificación y genotipificación:

El sistema de serotipificación de Salmonella spp. es considerado como uno de los mejores métodos de tipificación fenotípica de bacterias. Tiene un alto poder discriminatorio, provee información con significado epidemiológico. Sin embargo, entre sus desventajas se encuentra que algunas diferencias genéticas sutiles no son detectadas con métodos fenotípicos, por lo que se puede presentar error en la determinación de un serotipo o serovariedad específica. De otra parte, este método requiere de mano de obra altamente calificada y consume mucho tiempo en su realización. Otro aspecto a considerar es que en algunos países la disponibilidad y el costo de antisueros de alta calidad son limitantes importantes para la realización de estas pruebas.

Los métodos moleculares han sustituido a los fenotípicos como forma de confirmar la proximidad entre cepas de bacterias involucradas en brotes. El genoma de Salmonella ha sido analizado usando diferentes técnicas moleculares como electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE), ribotipificación e hibridación por micro-arreglos (DNA-DNA hybridization microarray), y Ribotipificación de secuencias intergénicas (ISR) entre otros. Estos métodos detectan la heterogeneidad entre cepas del mismo serotipo y algunas de ellos establecen una correlación confiable entre fenotipo y genotipo.

Un aspecto importante a destacar es que la mayoría (si no todas) las técnicas moleculares utilizadas actualmente para la asignación del serotipo de Salmonella, se basan en la obtención de una colonia bien aislada. Razón por la cual la bacteriología básica es y seguirá siendo la base de cualquier diagnóstico de Salmonella.

En la experiencia de esta autora, la Ribotipificación de Secuencias Intergénicas (Intergenic Sequece Ribotyping - ISR), es una técnica confiable, de alto poder de discriminación y repetibilidad, de bajo costo. Esta técnica fue desarrollada por el equipo de trabajo de la Unidad de Investigación en calidad e inocuidad del huevo del departamento de Agricultura de los Estados Unidos (Egg Saftety and Quality Research Unit of USDA - ARS). Todos los resultados obtenidos del análisis de varias cepas de Salmonella aisladas de productos avícolas de diferentes países del mundo, indican que la secuenciación de una 10 región de aproximadamente 500 pb entre el gen ribosomal 5S y las regiones vecinas del gen dkgB, puede ser usada para la caracterización de cepas de Salmonella con altas especificidad y sensibilidad.

Técnicas moleculares como pruebas tamiz (“screening”) para la identificación de presencia de Salmonella:

Actualmente se cuenta con varias técnicas para la determinación de la “presencia – ausencia” de Salmonella. Estas técnicas son particularmente útiles cuando se tiene que procesar grandes cantidades de muestras, esto implica un gran consumo de materiales, tiempo y labor dedicada a muestras que pueden resultar negativas. El uso de una prueba “tamiz” (de “screening”) ofrece como gran ventaja una alta sensibilidad, lo que lleva a la detección de un mayor número de “presencias” o muestras positivas. Sin embargo, es importante anotar que estas técnicas también requieren de confirmación de los resultados “positivos” mediante bacteriología tradicional (estas técnicas son susceptibles de arrojar falsos positivos, de ahí la necesidad de confirmación). La confirmación de positivos es especialmente importante cuando se está iniciando el uso de la técnica. Otro aspecto a considerar es que una vez se establece la presencia de una muestra positiva, es necesario realizar el aislamiento de la bacteria con el fin de determinar con exactitud de que serotipo se trata. Dentro de estas técnicas de screening se pueden encontrar algunas basadas en PCR y otras basadas en el uso de fagos.

Diagnóstico e Identificación de serotipos de Salmonella a partir de muestras de avicultura: importancia de un buen muestreo.

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