Vacuna vectorizada

Las vacunas vectorizadas contra la Laringotraqueitis Infecciosa (LTI) son producto de la ingeniería genética en la que se ha desarrollado a partir de la inserción de genes del virus de la LT en un vector viral, que en este caso es el virus de la Viruela Aviar. El desarrollo de una vacuna con estas características tuvo entre otros objetivos, el de generar un nivel de inmunidad suficiente para que las aves vacunadas fueran capaces de resistir el desafío por el vLTI. Además, también se tomó en cuenta durante su desarrollo, evitar las reacciones postvacunales que se tienen con los virus vivos, pero uno de los aspectos que más sobresalen es que con una vacuna recombinante contra la LTI se evita la latencia del virus, vacunal o de campo, cuando se aloja en el nervio trigémino que provoca la enfermedad cuando sale de ese estado latente.

La vacunación contra la LTI con vacunas vectorizadas se inició en México en el 2006 y aunque se han corrido varios ensayos para demostrar su eficacia, éstos se han realizado principalmente en los Estados Unidos (Davison et al., 2006; Godoy et al., 2008). Poco se ha estudiado en México al respecto, además de que todos las investigaciones se han realizado en pollo de engorda (Etcharren, comunicación personal; Lechuga, comunicación personal).

Los objetivos de este estudio fueron evaluar la protección conferida por una vacuna vectorizada contra la LTI en gallinas reproductoras ligeras contra el desafío con el vLT, y valorar el nivel de inmunidad generado en las diferentes edades de la vida productiva de las aves.

Materiales & Métodos

Aves
Se utilizaron 30 reproductoras ligeras Hy Line provenientes de granjas comerciales: 10 gallinas de 30 semanas, 10 gallinas de 40 semanas y 10 gallinas de 55 semanas de edad, vacunadas con una vacuna vectorizada viruela-LTI a las 10 semanas de edad por punción en el pliegue del ala a dosis completa. Cinco aves SPF (Aves Libres de Patógenos Específicos, S. A. de C.V., Tehuacán Pue.) fueron usadas como grupo control. Las aves tuvieron acceso al agua y alimento balanceado ad libitum durante todo el período que duró la prueba.

Desafío
El desafío se realizó con una cepa del virus de la LTI aislado en la zona de Tehuacán, Puebla, de un caso clínico en aves de postura comercial, sin que tenga este ningún nombre de referencia. Cada ave recibió la inoculación de 0,2 ml por vías intranasal, intraocular e intratraqueal del vLT conteniendo un título de 10^4.0 DIE_50%/ml.

Diseño experimental
Las aves se alojaron en tres grupos divididos por edad, en unidades de aislamiento con aire filtrado a presión negativa tipo Horsfall-Bauer. Adicionalmente, junto con las gallinas de 30 semanas, se alojaron cinco aves SPF como grupo control para toda la prueba. De cada grupo se sangraron el total de las aves al principio y al final para realizar la prueba de Inmunoensayo enzimático (ELISA) de LT utilizando el kit comercial CIVTEST-AVI-ILT (Hipra). Después del desafío, las aves fueron observadas diariamente durante 14 días reportando si se presentaban o no signos clínicos de LT (cabezas hinchadas, blefaroconjuntivitis, exudado nasal, y disnea). Al día 14 postdesafío, las aves fueron sacrificadas y revisadas a la necropsia, valorando la presencia de lesiones sugestivas de LT (moco, exudado caseoso o hemorragias en laringe y tráquea). De todas las aves, se extrajo la tráquea para histopatología. El criterio de protección principal fue la ausencia de signos clínicos y de lesiones a la necropsia. El criterio de protección para este parámetro, según el Code of Federal Regulations (9CFR) Animals and products; part 113.328 (2008), es la presencia o ausencia de signos y lesiones características de LT (Blefaroconjuntivitis, lagrimeo, exudad nasal y expectoración en un período de 14 días (9CFR 113.328). A la necropsia, exudados en tráquea y hemorragias. , de tal manera que el porcentaje de protección del grupo tratado debe ser igual o mayor que el 80%, y el grupo control desafiado debe mostrar lesiones en el 90% de las aves.

En la tabla 1 se resumen los resultados de la observación clínica. En el grupo SPF control hubo un ave muerta durante el período de observación. Sin embargo, ésta no tuvo relación con la LT.

Tabla 1. Presencia de signos clínicos de LT realizada en dos etapas de la prueba, de 1 a 6 días postdesafío y del 7 al 14 postdesafío. La tabla muestra las aves positivas/aves probadas

En relación al número de aves con lesiones en tráquea y el porcentaje de protección después de la infección con virus de Laringotraqueitis infecciosa, se pudo observar que la protección del grupo control fue de 0 (cero), los grupos de 30 y 55 semanas de 80% y el grupo de 40 semanas alcanzó el 100% de protección. En todas las aves que se reportaron lesiones macroscópicas presentaron exudado mucoso a mucopurulento moderado.

Se realizó el análisis histológico de todas las aves de los diferentes grupos que conformaron la prueba. En el grupo control, 2 aves presentaron cambios significativos: áreas de metaplasia con pérdida de cilios. En la lámina propia presentaron moderado infiltrado linfocítico, y se apreciaron células epiteliales en el lumen. El grupo de gallinas de 30 semanas presentó metaplasia con pérdida de cilios e hiperplasia moderada en el epitelio y moderado infiltrado linfocítico en dos aves. El diagnóstico morfológico fue de traqueitis linfocítica moderada difusa. Para el grupo de 40 semanas, ninguna de las aves presentó lesiones significativas. Por otro lado, el grupo de 55 semanas tuvo 3 aves con lesiones microscópicas, metaplasia con pérdida de cilios. En la lámina propia se observó moderado infiltrado linfocitario y solamente en una de las aves se presentó áreas de hemorragia y desprendimiento de células epiteliales. El diagnóstico morfológico para este caso fue de traqueitis linfocítica moderada difusa. Por otro lado, en la tabla 2 se resumen los resultados de serología

 Tabla 2. Resultados de serología obtenidos antes y después del desafío marcados como inicial (día 1 de la prueba) y final (día 14 post-desafío-PD-). Las dos primeras columnas marcan el índice SP (Sample positive), y las dos columnas restantes marcan la media geométrica del título de ELISA y entre paréntesis el coeficiente de variación

PD=Post-desafío

De acuerdo al 9CFR 113.328 del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA por sus siglas en inglés), el resultado del ensayo realizado de desafío se consideró satisfactorio, puesto que ninguna de las aves incluidas en los grupos de 30, 40 o 55 semanas de edad presentaron signos de LT. Con respecto a las lesiones macroscópicas, las aves de 30 y 55 semanas presentaron un 80% de protección según el 9CFR, y aún se considera aceptable. El mejor nivel de protección en términos de signos y lesiones se obtuvo en el grupo de 40 semanas, que sumado a las pruebas de histopatología y serología, permite inferir que la consolidación de la respuesta inmune es un proceso que se genera desde la aplicación de la vacuna y que alcanza su máximo nivel a las 40 semanas de edad, o 30 semanas postvacunación, para después mostrar un descenso a las 55 semanas de edad, pero manteniendo el nivel protectivo contra el desafío del vLTI.

La protección que es generada por las glicoproteínas del vLT han sido ampliamente estudiada, y entre estas sobresale la glicoproteína gB, pues tiene una participación determinante en la protección contra los herpes-virus (Riviere et al., 2002, Tong et al., 2001), aunque también se ha demostrado que la inmunidad mejora considerablemente cuando se le agrega otra glicoproteína como la UL-32 entre otras (Lee et al., 2003, Tong et al., 2001), proveyendo un nivel de inmunidad que oscila entre el 80 y 100% (Godoy et al., 2008; Davison et al., 2006). La vacuna evaluada contiene los genes que codifican las glicoproteínas gB y UL-32, y los resultados obtenidos en nuestra prueba de desafío contra el vLT coinciden con los obtenidos en trabajos similares, con la adición del factor de protección en términos de tiempo, pues se demostró un nivel de inmunidad suficiente contra el desafío desde las 30 semanas y hasta las 55 semanas de edad, equivalente a las 20 y 35 semanas postvacunación.

Las lesiones histológicas no han sido un parámetro a medir en las pruebas de desafío contra el vLTI, sin embargo, se incluyeron en este estudio para confirmar si tienen éstas alguna relación con las lesiones macroscópicas y los resultados de serología. Según nuestros resultados, no existe una correlación directa con la presencia de signos clínicos, ya que todas las aves del grupo control mostraron signos de LTI pero sólo tres presentaron lesiones microscópicas significativas. Por otro lado, las lesiones microscópicas mostraron tener relación con las lesiones macroscópicas y resultados de serología según nuestro criterio (ver tablas). Para esta prueba, queremos resaltar que el grupo de 40 semanas no presentó ningún tipo de lesión.

De igual manera que la histología, las pruebas de serología tampoco se han tomado como parámetro para medir la protección en pruebas de desafío con el vLTI, e incluso esta es una percepción que se extiende a nivel de producción avícola comercial, aclarando que las pruebas que se han utilizado son Virus neutralización y de Western-Blot. Adicionalmente, se ha demostrado que la protección contra el vLTI es más atribuible a la respuesta celular de tipo T-cooperadoras (Chan et al., 1985). Sin embargo, también se ha demostrado que las glicoproteínas del vLTI estimulan la respuesta inmune, tanto celular como humoral (York & Faher, 1991). La respuesta de anticuerpos contra LT no garantiza protección, sin embargo, está relacionada con la presencia o ausencia del antígeno (Chan et al., 1985) y su comportamiento en cuanto a replicación en la tráquea, donde una menor presencia de antígeno generará una menor respuesta serológica y por lo tanto la prevención de la forma clínica de la LT (York & Faher, 1991). La respuesta del grupo control a la presencia del antígeno fue clara al ser positivas postdesafío el 75% de las aves, también se reflejó este efecto en los grupos de 30 y 55 semanas, pero el grupo de 40 semanas mostró un comportamiento muy distinto. Esto es, si índice SP es el mayor de los tres grupos experimentales, pero después del desafío no se vuelven positivas todas las aves, indicando que muy probablemente el virus no se replicó tan eficientemente o tan libremente como en los otros grupos. El efecto observado en el índice SP se repite de una manera similar en el título de ELISA; el título del grupo de 40 semanas es el más alto de todos los grupos antes del desafío, y posteriormente es el que seroconvierte más bajo.

Chan WL, Lu-King ML, Liew FY. 1985. Helper T cells induced by an inmunopirified herpes simplex virus type 1 (HSV-1) 115 kilodalton glycoprotein (gB) protect mice against HSV-1 infection. J. Exp. Med. 162:1304-1318.

Code Federal of Regulations. 2008. Animals and animal products, Chapter I. Animal and plant health inspection service, department of agriculture.

Davison S, Gingerich E, Casavant S, Croade E. 2006. Evaluation of the efficacy of a live Fowl Pox-vectored infectious laryngotracheitis/avian encaphalomyelitis vaccine against ILT viral challenge. Avian. Dis. 50:50-54.

Godoy A, Flegg P, Oldoni I, García MC, Dorsey KM. 2008. Efficacy of a Vectormune Fowl Pox-laryngotracheitis vaccine and sequence comparison of recent ILTV field isolates. In the American Association of Avian Pathologist Meeting, New Orleans, LA.

Lee LF, Witter RL, Reddy SM, Wu P, Yanagida N, Yoshida S. 2003. Protection and synergism by recombinant Fowl Pox vaccine expressing multiple genes from Marek''''''''''''''''s Disease virus. Avian Dis. 47:549-588.

Riviere M, Tartaglia J, Norton EK Bongermino CM, Lacoste F, Duert F. 1991. Protection of mice and swine from pseudorabies virus conferred by vaccine virus-based recombinants. J. Virol. 66:3424:3434.

Tong GZ, Zhang SJ, Meng SS, Wang L, Qiu HJ, Wang YF, Yu L, Wang M. 2001. Protection of chickens from Infectious Laryngotrachitis with a recombinant Fowl Pox virus expressing glycoprotein B of Infectious Laryngotracheitis virus. Avian Pathol. 30:143-148.

York JJ & Faher KJ. 1991. Vaccination with affinity-purified glycoproteins protects against Laryngotracheitis herpesvirus. Avian Pathol. 20:693-704.