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Vacuna recombinante

Desarrollo de una vacuna recombinante y su eficacia en una prueba con pollo de engorda

Publicado: 18 de octubre de 2011
Por: JA Morales, E Merino, D García, R Ortega, Nancy Christy, Daniel Marrufo Villa, R Cascante, Eduardo Lucio, Mario A. Cruz Gomez (Investigaciones Aplicadas S.A. - IASA), Angel Absalón, DV Cortés, A Mariano, A Vazques (Instituto Politécnico Nacional), Di
Resumen

Con el objetivo de lograr un control más efectivo de los problemas causados por el virus de la Enfermedad de Newcastle (ENC) en regiones específicas, se desarrolló una vacuna viva recombinante que expresa el gen de la proteína de alta patogenicidad hemaglutinina-neuraminidasa (HN) de un virus del genotipo V (Cepa P05). Esto fue realizado a través de técnicas de genética inversa. El virus velogénico utilizado en el desarrollo de esta vacuna fue modificado genéticamente en el sitio de corte de su proteína de Fusión con el objeto de cambiar su genoma altamente patogénico a uno similar al de la cepa La Sota y así disminuir su virulencia. Se realizó un experimento en campo para evaluar la protección de la vacuna en una parvada de pollo de engorda y sus efectos en los parámetros productivos en comparación con la aplicación de una vacuna con cepa La Sota. Los resultados para el grupo vacunado con el virus experimental mostraron una menor mortalidad, menor edad a venta, mejor conversión alimenticia y mejor índice de productividad. Además, se determinó la excreción viral, la cual fue menor en el grupo que recibió la vacuna experimental. Palabras Clave: Enfermedad de Newcastle, Homología, Genotipo V, Virus recombinante, Proteína de fusión.

Introducción
La presencia del virus de la Enfermedad de Newcastle en su presentación velogénica continúa siendo un grave problema en la avicultura a nivel mundial. Las medidas de bioseguridad y vacunación son actualmente los métodos de control disponibles más efectivos para su control. Sin embargo, la diversidad antigénica y genética del virus ha distanciado filogenéticamente a las cepas vacunales actuales de los aislamientos velogénicos recientes encontrados en América Central, Sudamérica (Miller et al., 2010), algunas regiones de Estados Unidos (Peedersen et al., 2004) y México pertenecientes al Genotipo V, de la clase II (Perozo et al., 2008). Dicha heterología podría facilitar la evolución de virus de la ENC virulento (Miller et al., 2007). En un estudio Lucio et al.(2007), demostraron la distancia filogenética entre cepas de campo aisladas en México y la cepa La Sota, ampliamente utilizada en este y otros países. Diversos estudios se han realizado para comparar la eficacia de las vacunas utilizadas frecuentemente y las vacunas con cepas homólogas a los desafíos (Miller et al., 2009). Existe evidencia reciente de que el uso de vacunas homólogas a los virus de desafío puede reducir la excreción viral. Miller et al. (2007) mostraron que una vacuna homóloga a la cepa de desafío (CA02 del genotipo V) redujo la excreción viral oral significativamente más que las vacunas heterólogas inactivadas con cepas como la B1 y la Ulster (Genotipo II y I respectivamente). Hu et al. (2009) mostraron efectos similares contra virus de genotipo VII.
EL objetivo de este trabajo fue desarrollar una vacuna con un virus recombinante (quimera) que exprese el gen de la hemaglutinina-neuraminidasa de un virus del Genotipo V (clase II) realizando una modificación en la secuencia genética a nivel del punto de ruptura de su proteína de fusión y determinar su eficacia contra la mortalidad ante un desafío de campo, y sus efectos en los parámetros productivos en una parvada de pollo de engorda, así como en la excreción viral.
Materiales y Métodos

Desarrollo de la cepa vacunal recombinante recP05
El genoma en forma de ARN de la cepa La Sota fue proporcionado por el Laboratorio de Biología de Investigación Aplicada S. A. de C.V. La cepa P05 fue aislada en el año 2005 por Investigación Aplicada S.A. de C.V. y su genoma en forma de ARN fue proporcionado por el Laboratorio de Biología de la misma empresa.
Se utilizó el método de la transcriptasa reversa y se diseñaron cebadores específicos para la amplificación y secuenciación de los virus. Se realizó el cambio secuencial en el sitio de ruptura de la proteina F de la cepa P05 a la misma secuencia del virus de La Sota. Finalmente, se construyeron tres vectores plasmídicos de expresión pIASAP, pIASANP y pIASAL para los genes P, NP y L del virus P05 para las proteínas que conforman el complejo de la ARN polimerasa y se recuperó el virus en células Hep 2 tras ser infectado con el virus "Vaccinia" modificado Ankara para expresar la ARN polimerasa del bacteriófago T7. Se presenta la construcción final del genoma del virus recombinante en la figura 1.
Figura 1. Construcción del virus cepa recP05.
Desarrollo de una vacuna recombinante y su eficacia en una prueba con pollo de engorda - Image 1
Uso de la vacuna con cepa recP05 en una parvada de pollo de engorda
Se evaluó la protección proporcionada por la vacuna recombinante del genotipo V recP05 en una granja de pollo de engorda en la que se emplearon un total de 299.943 pollos de la estirpe Ross, los cuales fueron divididos en 2 grupos: Grupo A de 96.869 pollos y Grupo B de 203.074 pollos. Las aves de ambos grupos recibieron el mismo manejo médico y zootécnico. Por ello, todas fueron vacunadas con una vacuna bivalente a virus inactivo contra la ENC (genotipo V) e Influenza Aviar (A/Chicken/México/232/94CPA) en emulsión al día 1 y 10 de edad. A los días 10, 20 y 31 de edad las aves del Grupo A recibieron la vacuna experimental a virus vivo de ENC, cepa del genotipo V (recP05), mientras que las del Grupo B recibieron una vacuna a virus vivo de ENC, cepa del genotipo II (La Sota). En la granja se realizaron las mismas prácticas de manejo, alimentación y bioseguridad para ambos grupos, y se llevó el registro de los siguientes parámetros productivos de la parvada: total de bajas, porcentaje de mortalidad, edad promedio de venta, peso promedio de venta, conversión alimenticia, ganancia diaria de peso (GDP) e índice de productividad. Se recolectaron hisopos traqueales a las 4, 5 y 6 semanas para detección de partículas virales por PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) en tiempo real. Se realizó aislamiento y secuenciación genética del virus.
Resultados & Discusión

Porcentaje de Mortalidad (%)
El Grupo A vacunado a virus vivo con cepa del Genotipo V mostró una mortalidad menor (4,76 %), con una diferencia de 12,17 % respecto al Grupo B (16,93 %) vacunado con cepa del genotipo II (Tabla 1).
Edad promedio de venta (días)
El Grupo A vacunado a virus vivo con cepa del Genotipo V resultó con 0,8 días menos a la venta (42,1 días) en comparación con las aves del Grupo B vacunadas a virus vivo con cepa del Genotipo II (42,9 días) (Tabla 1).
Peso promedio de venta (gramos)
El Grupo A vacunado con la vacuna experimental con virus vivo recP05 mostró 98 g menos a la venta (1,965 g) en comparación con el Grupo B vacunados a virus vivo con cepa del Genotipo II (2,063 g). (Tabla 1)
Conversión alimenticia
El Grupo A vacunado a virus vivo, cepa del Genotipo V mostró 0,056 mejor conversión alimenticia o 56 gramos menos de alimento consumido por kilogramo producido (1,902) en comparación con el Grupo B vacunados a virus vivo con cepa del Genotipo II (1,958).
Ganancia diaria de peso (gramos)
El Grupo A vacunado a virus vivo con cepa del Genotipo V tuvo 1,34 g menos de GDP al final de la engorda (46.44 g) en comparación con el Grupo B vacunados a virus vivo con cepa del Genotipo II (47.78 g). (Tabla 1)
Índice de productividad
El Grupo A vacunado a virus vivo con cepa del Genotipo V mostró un mejor índice (214,40) en comparación con el Grupo B vacunados a virus vivo con cepa del Genotipo II (202,68). (Tabla 1)
Tabla 1. Parámetros productivos de la parvada y diferencia de resultados entre Grupo A y Grupo B.
Parámetro productivo
Grupo A
Grupo B
Diferencia
Grupo A vs. Grupo B
No. de aves
96.869
203.074
 
Edad promedio a la venta (días)
42,1
42,9
0,80 días
Peso promedio a la venta (g)
1,965
2,063
- 98 g
Conversión alimenticia
1,902
1,958
- 0,056
Ganancia de peso diaria (g)
46,44
47,78
- 1,34 g
% de Mortalidad final
12,17 a
16,93 a
- 4,76 %
Índice de productividad
214,40
202,68
11,72
En la semana 4, la prueba de PCR en tiempo real fue positiva en ambos grupos. Sin embargo, se observó un título mayor de partículas virales en el Grupo B vacunado con cepa La Sota, con una diferencia logarítmica (Tabla 2). Se realizó secuenciación genética y se identificó al virus del genotipo V. El aislamiento viral demostró la presencia de virus velogénico.
Tabla 2. Excreción viral. Resultados de PCR en tiempo real de detección de partículas virales en exudado faríngeo.
Grupo A
Grupo B
Resultado
Título DI/mL
Resultado
Título DI/mL
Semana 4
Positivo
6.3X105
Positivo
2.04X106
Semana 5
Negativo
No detectable
Negativo
No detectable
Semana 6
Negativo
No detectable
Negativo
No detectable
Los resultados obtenidos coinciden con lo observado por Miller et al. (2007) quienes demostraron que vacunas elaboradas con virus homólogo al de desafío redujeron más la excreción viral que las vacunas heterólogas, por lo que sugieren que las vacunas formuladas para ser filogenéticamente más cercanas al virus potencial de desafío pueden facilitar el control de la ENC reduciendo la transmisión a partir de las aves infectadas. Las vacunas utilizadas en la actualidad generalmente protegen contra la morbilidad y mortalidad en desafíos de campo. Sin embargo, de acuerdo con van Boven et al. (2008) la efectividad de las vacunas debe ser determinada además de esto, por su capacidad para disminuir la excreción viral.
Conclusiones
En los últimos años se ha incrementado el interés por actualizar las cepas vacunales contra la ENC con el propósito de brindar una mayor protección a las parvadas controlando la recirculación de virus en las granjas por la excreción viral que generalmente se detecta en las aves que reciben vacunas con cepas heterólogas. El uso de la vacuna elaborada con un virus recombinante de genotipo homólogo al de un virus de campo demostró que es posible ofrecer una adecuada protección contra la mortalidad y brindar un mejor control de la excreción viral, además de mejorar los parámetros productivos de una parvada de pollo de engorda. Esto demuestra que son consistentes los beneficios que se obtienen con el aprovechamiento de los avances en tecnología genética y con el análisis de la situación en el campo en relación a una enfermedad que sigue preocupando tanto a la industria como a la comunidad científica que busca mejorar los métodos para controlarla.
Bibliografía
Hu S, Ma H, Wu Y, Liu W, Wang X, Liu Y, Liu X. 2009. A vaccine candidate of attenuated genotype VII Newcastle disease virus generated by reverse genetics. Vaccine 27:904-910.
Lucio E, Morales A, Ortega R, Rodríguez A, Absalón A. 2007. Características de los virus de la enfermedad de Newcastle que circulan en México y sus repercusiones en protección y persistencia en las zonas afectadas. Tehuacán, Pue., México. Investigación Aplicada SA de CV e Instituto de Biotecnología del IPN, Tlaxcala, México.
Miller PJ, King DJ, Afonso CL, Suarez DL. 2007. Antigenic differences among Newcastle disease virus strains of different genotypes used in vaccine formulation affect viral shedding after a virulent challenge. Vaccine 25:7238-7246.
Miller PJ, Estevez C, Yu Q, Suarez D, King D. 2009. Comparison of viral shedding following vaccination with inactivated and live Newcastle disease vaccines formulated with wild-type and recombinant viruses. Avian Dis. 53:39-49.
Miller PJ, Lucio E, Afonso CL. 2010. Newcastle disease: Evolution of genotypes and the related diagnostic challenges. Infection Gen. Evol.10:26-35.
Pedersen JC, Senne DA, Woolcock PR, Kinde H, King DJ, Wise MG, Panigrahy B, Seal BS. 2004. Phylogenetic relationships among virulent Newcastle disease virus isolates from the 2002-2003 outbreak in California and other recent outbreaks in North America. J. Clin. Microbiol. 42:2329-2334.
Perozo F, Merino R, Afonso CL, Villegas P, Calderon N. 2008. Biological and phylogenetic characterization of virulent Newcastle disease virus circulating in Mexico. Avian Dis. 52:472-479.
Van Boven M, Bouma A, Fabri TH, Katsma E, Hartog L, Koch G. 2008. Herd immunity to Newcastle disease virus in poultry by vaccination. Avian Pathol. 37:1-5.
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Autores:
Mario A. Cruz Gomez
IASA
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Eduardo Lucio
Boehringer Ingelheim
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Angel Absalón
Instituto Politécnico Nacional (México)
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Diego Rodríguez Saldaña
Universidad de Cuenca
23 de febrero de 2012
Una consulta, a que altitud fue desarrollado el experimento? Las preguntas del Colega Jose Antonio sin duda son necesarias, especialmente para comprender los parametros productivos alcanzados. Diculpen la falta de acentos, pero es cuestion de este teclado. Saludos Diego Rodriguez S. NUTRIOLOGO BALANCEADOS EL GRANJERO Cuenca - Ecuador
Mvz Jose Antonio Olmedo Sanchez
22 de febrero de 2012
Felicitaciones a todos ustedes los investigadores de IASA por este articulo de suma importancia en nuestro medio avicola, solo me restaria hacerles una pregunta los datos obtenidos son de parvadas de hembras, machos o parvadas mixtas por un lado y por el otro lado si me pueden aclarar porque la ganancia diaria de peso es mayor en el grupo B ya que contrariamente se pensaria que ante la mejor protección vacunal mayor seria el incremento de peso en el grupo A. Por ultimo me gustaria preguntarles como se presento la reacción pos vacunal en los dos lotes y si no existe variación por el numero diferente de aves en este experimento gracias.
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