Mycoplasma Gallisepticum
Aislamiento y caracterización molecular de Mycoplasma Gallisepticum y Mycoplasma Synoviae, en aves reproductoras y ponedoras comerciales en Venezuela
Se realizó un estudio para aislar e identificar molecularmente Mycoplasma gallisepticum (M.g) y M. synoviae (M.s) en 28 granjas avícolas en Venezuela: 12 granjas reproductoras pesadas (RP) y 16 granjas ponedoras comerciales (PC). De las RP 90% recibieron vacuna contra M.g (cepa F), pero no contra M.s. Estudios serológicos previos por prueba rápida en placa (PRP) y ELISA identificaron 42 lotes positivos, de los cuales se tomaron hisopados traqueales en caldo Frey para aislamiento del germen y en tarjetas FTA® para estudio molecular. Los resultados de ELISA revelaron una prevalencia para M.g. de 73,64% en PC y 54,38 % en RP; para M.s se obtuvo una prevalencia de 64,12% para PC y 55,87% para RP. El aislamiento del patógeno se realizó mediante técnicas convencionales, obteniendo 29 cepas de mycoplasmas (78,57% de las granjas analizadas). Para la identificación genómica se usó PCR, utilizando primers 16S rRNA correspondientes a la proteína de matriz, y para la secuenciación se utilizaron los primers mgc2 que codifican para la proteína citoadhesina para M.g. y Ms-vlha que codifican para la proteína hemoaglutinina de M.s, los cuales permiten diferenciar cepas vacunales de la cepas de campo. Como resultado en PC con primers del gen 16S rRNA se obtuvo 8 cepas de M.g y 7 de M.s. El análisis de secuencia con los primers mgc2 se obtuvieron 2 cepas vacunales (cepa F) y 2 cepas de campo; con MS-vlha se obtuvieron 7 cepas de campo. Como resultado en RP con primers del gen 16S rRNA se obtuvo 11 cepas para M.g y 3 para M.s. Con primers mgc2 se obtuvieron 9 cepas vacunales (cepa F) y 2 cepas de campo; con MS-vlha. se obtuvieron 3 cepas de campo. En conclusión, podemos asegurar la presencia de cepas de campo de M.g y M.s en los lotes de PC y RP en Venezuela.
Palabras Clave: Aislamiento, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, ADN, PCR.
Summary
A study was conducted for the isolation and molecular identification of Mycoplasma gallisepticum (MG) and M. synoviae (MS) strains in 28 poultry farms in Venezuela (12 farms of broiler breeder farms and 16 commercial layer farms). Vaccinations against MG (F strain) were performed in 90 % of the breeder farms examined, but not against MS. Previous serological studies (PRP and ELISA) identified 42 flocks positive to this disease. Tracheal swabs were collected in Frey broth medium for mycoplasma isolation and on FTA® cards for molecular identification. ELISA results showed 73.64% prevalence of MG in the commercial layers and 54.38% in the broiler breeders. Prevalence of MS was 64.12% in layers and 55.87% in broiler breeders. The isolation of pathogens was carried out by conventional techniques, obtaining 29 mycoplasma strains corresponding to 78.54% of the farms examined. The genomic identification was performed by conventional PCR. For the initial detection of mycoplasma, 16 rRNA primers were utilized, corresponding to the matrix proteins. For sequencing purposes, we used mgc2 primers encoding for the cyto adhesin protein of MG and MS MS-vlha primers encoding for the hemagglutinin protein of MS, which allow for the differentiation between vaccine strains and field strains. PCR results in commercial layers utilizing the 16S rRNA primers yielded 8 positive strains for MG and 7 for MS. PCR-sequencing using mgc2 primers revealed the presence of 2 vaccine strains (F strain) and 2 field strains. PCR-sequencing using MS-vlha primers revealed 7 field strains. PCR results in commercial layers utilizing the 16S rRNA primers yielded 11 positive strains for MG and 3 for MS. PCR sequencing using mgc2 primers revealed the presence of 9 vaccine strains (F strain) and 2 field strains. In conclusion, we can assure the presence of field MG and MS strains in the broiler breeder and commercial layer flocks in Venezuela.
Key Words: Isolation, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, DNA, PCR.
Se realizó en dos fases
Fase de campo: toma de muestras de sangre, hisopados traqueales y muestras en tarjetas FTA®.
Fase de laboratorio: se realizó la detección de anticuerpos específicos contra M.g y M.s a través las técnicas PRP y ELISA. El aislamiento de M.g y M.s se realizó mediante técnicas estándares de cultivos (Anónimo, 1994), utilizando hisopados traqueales tomados de aves vivas en granjas y en 2 casos de necropsia. La caracterización molecular del M.g y M.s se realizó mediante la PCR (Moscoso et al., 2004) en el INIA-Venezuela y la secuenciación parcial de nucleótidos (ABI Prism DNA sequencing kit and ABI Prism 3100 genetic analyzer (Applied Biosystems, Foster City CA,) en el Departamento de Instrumentación Genética Molecular de la Universidad de Georgia, USA. Los ADN extraídos de caldos de Frey positivos al aislamiento se analizaron por PCR con el uso de primers Invitrogen®: MG-14F 5´ GAG CTA ATC TGT AAA GTT GGT C-3´; MG-13R 5´ GCT TCC TTG CGG TTA GCA AC-3´ de 186 pb y MSLF 5´ GAG AAG CAA AAT AGT GAT ATC A-3´ y MSLR 5´ CAG TCG TCT CCG AAG TTA ACA A-3´de 214 pb, correspondientes a la proteína de matriz como screening. Para el diagnóstico diferencial entre cepa vacunal y de campo se usaron primers Invitrogen®: MG-c2-F 5´ CGC AAT TTG GTC CTA ATC CCC AAC A-3´ y MG-c2-R 5´TAA ACC CAC CTC CAG CTT TAT TTC C-3´ de 237-303 bp; MS vhla-F 5´GAT GCG TAA AAT AAA AGG AT-3´, MS vhla-R 5´GCT TCT GTT GTA GTT GCT TC-3´ de 316-395 bp.
El análisis de la secuencia de nucleótidos se realizó en el Laboratorio Avian Diagnostic en Georgia (USA) usando the Lasergene program (DNASTAR, Inc. Madison, WI. y la nucleotide-nucleotide Blast data base NCBI -National Center for Biotechnology Information-).
Resultados & Discusión
Detección de anticuerpos específicos
PRP de 696 muestras en RP se obtuvo para M.g directa y diluciones rangos entre 62,07-65,66 % y para M.s se mantuvo en 33,19%. En PC de 734 muestras para M.g directa y diluciones entre 60,49-68,39 % y para M.s 32,43-43,19 %. El 90 % de granjas de RP utilizaron vacuna contra M.g (cepa F), no así las granjas de PC donde su uso es más restringido. Para M.s, ninguna de las granjas reportaron uso de vacunas, y se observó que las PC mostraron un mayor porcentaje de positividad. Sin embargo, se ha planteado que lotes de aves pudiesen presentarse reactores no específicos o falsos positivos, debido a recientes aplicaciones de vacunas oleosas o la utilización de biológicos producidos en tejidos vivos contra otros agentes infecciosos (Kleven, 1994; Contreras, 2000). En PC M.s presentó un mayor porcentaje de positividad a la prueba, considerada como indicios de infecciones recientes, posiblemente debido a que en este tipo de explotaciones alojan aves de diferentes edades con condiciones de bioseguridad deficientes.
El análisis de los datos de prevalencia global en RP y PC revela co-infecciones de ambos microorganismos, sin embargo, en muchos casos esta asociación pasa desapercibida debido a la mayor importancia que se le da comúnmente a M.g (Godoy, 1999). Para ELISA en las RP de 537 muestras: M.g 54,38 % y M.s 55,87% de positivos.
La seroprevalencia en RP fue ligeramente superior para M.s, aunque conocemos que estas aves fueron vacunadas en un 90 % contra M.g. Para PC en 588 muestras se evidenció 73,64 % para M.g y 64,12 % para M.s de positivos. En este caso, la seroprevalencia de M.g fue superior; la mayoría de estos lotes no recibieron vacunaciones contra M.g ni contra M.s. Las IgG en el caso de los mycoplasmas aviares se presenta entre 1 y 6 semanas post vacunación o infección por cepas de M.g o M.s de campo (Ross, 2009).
Para las RP vacunadas se infiere que la respuesta serológica se debe al uso de cepas vacunales, las cuales producen una repuesta inmune fuerte y detectable por un periodo mayor a 12 semanas (Contreras, 2000, Ricci 2005). Caso contrario al que se presenta en las PC donde no se reportó el uso de vacuna de M.g, sin embargo, se detectaron títulos debidos, posiblemente, a la infección crónica y circulante entre lotes. Para M.s ambas poblaciones en estudios no recibieron vacunaciones, por lo que los resultados obtenidos corresponden a seroconversión por exposición a cepas de campo presentes en las explotaciones estudiadas.
Se obtuvo 29 aislamientos de mycoplasmas en 28 protocolos analizados, observando alta relación con los resultados obtenidos en la PRP correspondiente a infecciones recientes y activas. Se observaron colonias típicas al microscopio de luz indirecta a baja magnificación (40 X). Se realizaron algunas modificaciones como la adición de 2000 UI de penicilina a los caldos Frey en muestras tomadas en campo, para limitar el crecimiento de contaminantes, mejorando la observación de las colonias. Con la PCR usando primers MG-14F / MG-13R / MSLF y MSLR se identificaron 19 cepas de M.g y 10 de M.s. De 12 granjas de RP analizadas resultaron positivas 11 a M.g. (91,67%) y 3 a M.s. (25%). Mientras que de 16 granjas de PC analizadas, en 8 detectaron M.g. (50%) y en 7 M.s. (43,75%). Usando primers mgc2 y MS-vlha en RP se identificaron 11 para M.g, y 3 para M.s. En PC se identificaron 4 para M.g, y 7 para M.s. El análisis de secuencia del gen mgc2 en RP determinó que 9 muestras presentan porcentaje de identidad de 100 % con: cepa F, cepa E4-08 (Egipto), cepa K5152AC01 y con cepa K4781ATK99; una muestra con 99,5 % de identidad con cepa F, cepa E4-08 (Egipto), cepa K5152AC01 y con cepa K4781ATK99; una muestra con 97,9 % de identidad con cepa F, cepa E4-08 (Egipto), cepa K5152AC01 y con cepa K4781ATK99 cuando fueron comparadas con cepas de la base de datos GenBank.
El producto de la amplificación del gen M.s vlha. no pudo ser secuenciado con el método utilizado. En las RP vacunadas la cepa vacunal compite con las cepas de campo, por lo que podrían estar presentes ambas. En este estudio se obtuvo una cepa con similitud de 97,9% con cepa F, la cual podría ser considerada como una cepa de campo. Las cepas de M.s no mostraron resultados de secuencias.
Harada et al. (2009), plantea que no siempre, el análisis con este gen puede determinar las diferencias moleculares entre cepas de campo y cepas vacúnales. El análisis de secuencia del gen mgc2 en PC se obtuvieron 4 secuencias las que fueron analizadas, observando dos muestras con 100 % de identidad con cepa F, cepa Rab E4-08 (Egipto), cepa K4781ATK99, cepa K5058ETK01 y con la cepa K5152AC01; una muestra con 99 % de identidad con cepa F y 98,9 % de identidad con cepa Rab E4 -08 (Egipto), cepa K4781ATK99, cepa K5058ETK01 y con la cepa K5152AC01; una muestra con 93,7% de identidad con cepa F, cepa Rab E4-08 (Egipto), cepa K4781ATK99, cepa K5058ETK01 y con la cepa K5152AC01 de la base de datos del GenBank. No se logró la secuenciación de los otros 4 aislados para M.g. Para M.s con M.s vlha se obtuvo la secuencia de 7 muestras; de las cuales tres tuvieron un porcentaje de identidad de 100% con: cepa EsPKUAF08 (Pakistán), cepa B95-04-K4412 (España); 90,4% con la cepa H y con cepa 94011 (Australia); una muestra con 99,6 % de identidad con cepa EsPKUAF08 (Pakistán), cepa B95-04-K4412 (España); 90% con la cepa H y con la cepa 94011 (Australia); una muestra con 98,8% de identidad con cepa EsPKUAF08 (Pakistán), cepa B95-04-K4412 (España); 89,2% con la cepa H y con cepa 94011 (Australia); dos muestras con 90,4% de identidad con cepa EsPKUAF08 (Pakistán), cepa B95-04- K4412 (España); 99,2% con la cepa H, cepa 94011 (Australia) y con la cepa untilclone V8 MSPB.
Los resultados confirman que existe una amplia variedad de cepas de mycoplasmas en estas poblaciones de aves venezolanas, lo cual constituye una problemática de mayor dimensión en este tipo de explotaciones. Las cepas no secuenciadas de M.s en RP y M.g en PC, pudieran deberse a cepas que difieren a las que comúnmente son identificadas con el uso de los primers mgc2 y M.s vlha. Estos genes minimizan la posibilidad de reacciones cruzadas en los diagnóstico de mycoplasmas por PCR (Takahashi-Omoe et al., 2004), y han sido aplicados en trabajos de caracterización molecular de M.g y M.s en pollos (Evans & Leigh, 2008).
Nuestro trabajo detectó que en el 100 % de los casos aislados se obtuvo resultado de identificación genómica por la técnica de PCR, ya sea para M.g o M.s, o ambos a la vez, por lo que se corrobora que la técnica es eficaz para el diagnóstico de las cepas de Mycoplasma y que puede darse combinación de ambos patógenos dentro de una misma población aviar. (Godoy, 1999, Ricci, 2005). Para la secuenciación los primers mgc2 y el primers M.s vlha, logran la diferenciación entre cepas de M.s y M.g y la diferenciación entre cepas vacunales de M.g (Raviv & Kleven, 2008), o la identificación de cepas de vacunas de M.s utilizando el gen vhla (Harada et al., 2009). No obstante, existen diseños de otros primers que también han podido ser utilizados para la diferenciación de cepas de vacunas de Mycoplasma gallisepticum ts-11 y cepa 685 (Evans & Leigh, 2008).
Conclusiones
Bibliografía
- Anónimo. 1994. Poultry Mycoplasma Workshop, American College of Poultry Veterinarians, Western Poultry Disease Conference. University of California; Davis, California, USA
- Contreras M. 2000. Interpretación de pruebas serológicas para M. gallisepticum en aves vacunadas. Ind. Avícola. Marzo: 16-20.
- Evans JD & Leigh SA. 2008. Differentiation of Mycoplasma gallisepticum vaccine strains ts-11 and 6/85 from commonly used Mycoplasma gallisepticum challenge strains by PCR. United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Poultry Research Unit, Mississippi state, M.s. 39762.
- Godoy A. 1999. Prevalencia de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae en gallinas ponedoras. Universidad Central de Venezuela. Tesis de grado para optar al titulo de Magíster Scientarum en Medicina Veterinaria, mención Microbiología. Ej. 757 UCV-FCV. Maracay.
- Harada K, Kijima-Tanaka M, Uchiyama M, Yamamoto, Oishi K, Arao M, Takahashi T. 2009. Tipificación molecular de cepas de campo de Japón y cepas vivas de la vacuna comercial de Mycoplasma synoviae mediante electroforesis y la secuenciación de genes vlhA. Avian Dis. 53(4):538-543.
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- Moscoso H, Stephan GT, Hofrace CL, Kleven SH. 2004. Inactivation, sStorage, and PCR detection of Mycoplasma on FTA filter paper. Avian Dis. 48:841-850.
- Raviv Z & Kleven SH. 2008. Desarrollo de técnicas diagnósticas mediante la reacción en cadena por la polimerasa utilizando el sistema TaqMan para la detección de cuatro micoplasmas aviares patogénicos. Desarrollo de técnicas diagnósticas Mediante la reacción en cadena por la polimerasa Utilizando el sistema TaqMan para la detección de cuatro micoplasmas aviares patogénicos. Enfermedades aviares 53(1):103-107.
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