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Infección experimental de pollos de un día de edad con serotipos de salmonella aislados de instalaciones avícolas, aves silvestres y cerdos

Publicado: 20 de octubre de 2011
Por: Eliana Sousa, K Werther, A Berchieri Junior, AM Almeida, CG Candioto, AC Silva - Universidad Estatal Paulista, Facultad de Ciencias Agrarias y Veterinarias, Jaboticabal, SP, Brasil.
Resumen

Se aislaron nueve serotipos de Salmonella de instalaciones avícolas, aves silvestres y cerdos, a saber: S. enterica subsp. enterica 4,5,12:R:-; S. Heidelberg; S. Infantis (cama aviária), S. Heidelberg; S. enterica subsp. enterica 6,7:R:-; S. enterica subsp. enterica 4,5,12:R:-; S. Tennessee (de heces de pollos de engorde), S. Glostrup; S. enterica subsp. enterica 6,8:d:- (agua), S. Tennessee (escarabajos negros -Alphitobius diaperinus- encontrados en cama de galpones avícolas), S. Panamá; S. Typhimurium (heces de cerdos criados en galpones de la misma propiedad), S. Heidelberg (carpinteros o "pica-pau" de campo -Colaptes campestris- de órganos y contenido intestinal). Los nueve serotipos de Salmonella aislados se inocularon experimentalmente, por vía oral, a grupos separados de 15 pollos de un día cada uno. Se observó la presencia de heces blandas en el piso de las jaulas y alrededor de la cloaca, lo que sugiere un cuadro diarreico, entre el día 3 (día posterior a la infección) y el día 12 postinfección. Las aves se convirtieron en portadoras y eliminaron las salmonelas en las heces hasta el último día del experimento (21 días).
Palabras Clave: Salmonella spp., Aves silvestres, Cerdos, Pollos de un día.

Introducción
Brasil está considerado actualmente como el mayor exportador de carne de pollo del mundo, y ocupa la tercera posición mundial en producción de esta carne (Unión Brasileña de Avicultores, UBA, 2009) y la quinta en producción de huevos (Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura, FAO, 2010).
Para conservar la avicultura brasileña y sus altos índices de producción y exportación, se requieren medidas de prevención y control de algunos agentes causantes de enfermedades infecciosas en aves, como por ejemplo Salmonella spp.
La incidencia de infección de origen alimentario en humanos por Salmonella spp. Ha aumentado en varias partes del mundo, a pesar de todo el desarrollo tecnológico en la producción de alimentos y de la adopción de mejores medidas higiénicas y sanitarias. Los alimentos de origen animal continúan siendo los principales responsables de la infección humana, incluyendo a la carne de aves, el huevo, y sus derivados (Gast et al., 2008).
Muchos serotipos del género Salmonella pueden sobrevivir por semanas o meses en las heces y en la cama de los pollos, en la excretas de aves silvestres, el equipo, los galpones (casetas, naves o galeras) vacíos, sus alrededores, las partículas  de polvo, los comederos y el alimento (Davies y Wray, 1996; Berchieri Junior y Freitas Neto, 2009).
El objetivo del presente trabajo fue investigar la presencia de Salmonella spp. En materiales procedentes de cuatro grupos de animales y sus ambientes: pollos de engorde, aves silvestres, heces de roedores que frecuentan instalaciones avícolas, y heces de cerdos criados en galpones de la misma propiedad, además de verificar la patogenia de estos diferentes tipos de Salmonella al inocularlos a pollos de un día.
Material y Métodos
La investigación se realizó en cooperación con una granja de pollo de engorde ubicada en el estado de São Paulo, Brasil. Se tomaron muestras de los pollos de engorde (cadáveres de pollos de un día y canales de pollos adultos, cajas de transporte de pollo al llegar a la granja, alimento en del silo y de los comederos, agua de abastecimiento de la granja y de los bebederos, heces [desde el primer día de vida hasta el sacrificio], cama del galpón y escarabajos [Alphitobius diaperinus] encontrados en la cama), de seis lotes de pollos, durante los 45 días de permanencia en la granja. Las aves silvestres que frecuentaban los galpones se capturaron durante un período de un año y, bajo la autorización del Instituto Brasileño del Medio Ambiente y Recursos Naturales Renovables (IBAMA, autorización No. 14909-1, registro IBAMA No. 1902993), se tomaron hisopos de cloaca, órganos y contenido intestinal de dichas aves. En total se analizaron 36 aves silvestres, capturadas todas ellas en el interior de los galpones de pollo de engorde, principalmente durante el vacío sanitario de los mismos. Durante este período se observó un aumento del número de aves silvestres dentro las naves, en busca de alimento. Entre ellas, 14 fueron el ani de pico liso, garrapatero o vacamuchacho (anu preto, Crotophaga ani), 9 tortolitas (rolinha, Columbina talpacoti), 3 tórtolas torcaza (pomba, Zenaida auriculata), 3 carpinteros (pica-pau do campo, Colaptes campestris), 2 pirinchos o sereres (anu branco, Guira guira), 2 borbas (pomba, Patagioenas plumbea), 2 queltehues (quero-quero, Vanellus chilensis) y un cristofué o bienteveo (bem-te-vi, Pitangus sulphuratus). Todas las aves se examinaron (estado nutricional, color de mucosas, orificios naturales y presencia de ectoparásitos) y ninguna presentó signos de alteración en los parámetros evaluados.
Se encontraron y recolectaron heces de roedores de diversas especies que frecuentan las instalaciones avícolas. En la misma propiedad existían, además de las naves de pollo de engorde, cuatro para producción de cerdos de varias fases del desarrollo, de las cuales se recolectaron muestras de heces.
Todas las muestras se colocaron en frascos estériles individuales que contenían agua peptonada al 1% y se incubaron durante 24 horas a 37°C. De este cultivo inicial se transfirieron 2 ml a tubos que contenían 20 ml de caldo selenito/novobiocina (SN) y alícuotas de 0.2 ml a tubos que contenían 20 ml de caldo Rappaport (RP), que se incubaron durante 24 horas a 37°C. En seguida, los caldos se sembraron en medios de gelosa MacConkey, Verde brillante (VB) y Xilosa Lisina Tergitol 4 (XLT-4) y se incubaron durante 24 horas a 37°C. Las colonias sospechosas de pertenecer al género Salmonella se inocularon en medios presuntivos TSI (triple azúcar y hierro) y LIA (gelosa lisina hierro) y se incubaron 37°C durante 24 horas. La fermentación y la tipificación se realizaron en el Instituto Adolfo Lutz de São Paulo, SP, Brasil.
Los serotipos de Salmonella aislados se prepararon para resistencia al ácido nalidíxico a una concentración de 50 µg/ml. Posteriormente todo los cultivos de Salmonella spp. se prepararon en 10 ml de caldo Luria-Bertoni (LB) a 37ºC durante 24 horas, bajo agitación (100 rpm). Después se diluyó  0.1 ml del cultivo en solución salina amortiguada de fosfato con pH 7.4 (PBS) en la proporción 1:10, para luego realizar soluciones decimalmente hasta 10-6. De cada dilución se transfirió 0.1 ml a una placa que contenía gelosa VB, que se incubó durante 24 horas a 37ºC. Transcurrido este tiempo, se procedió a contar las colonias. Los cultivos contenían 1.2 x 108 unidades formadoras de colonias/ml (UFC/ml).
Para la realización de la infección experimental se utilizaron pollos de un día de edad no vacunados contra la enfermedad de Marek, de una estirpe comercial, procedentes de una incubadora localizada en el estado de São Paulo. El experimento se realizó en salas aisladas con control de temperatura, iluminación (artificial) y ventilación, con nivel de bioseguridad dos. Las aves se mantuvieron en baterías metálicas recibiendo agua (esterilizada en autoclave) y alimento ad libitum. El alimento se elaboró a base de maíz, soya (soja) y premezcla, sin la adición de antibióticos. Se realizaron inicialmente cultivos para detectar la presencia de Salmonella spp. en el alimento y en el piso de las cajas de transporte (meconio) al momento de la llegada de los pollos procedentes de la incubadora. Las aves se separaron en grupos de 15 siendo que cada pollo recibió por sonda al buche 0.1 ml del cultivo que contenía 1.2 x 108 UFC/ml. Los animales se observaron dos veces al día en busca de la presencia de signos clínicos y mortalidad.
Después de la inoculación de Salmonella, se tomaron muestras de heces de la cloaca de cada ave a las 24 horas y a los 8, 15 y 21 días, usando hisopos de algodón estéril y, posteriormente, cada muestra se procesó de manera individual. La mitad del lote de aves se sacrificó por dislocación cervical a los 15 días postinfección (dpi) y el resto de los animales a los 21 días. Se tomaron hisopos de hígado, bazo y contenido cecal de cada ave para incubarlos en caldo selenito adicionado de novobiocina (SN) a 37°C por 24 horas. En seguida, los caldos se sembraron en placas que contenían gelosa VB con ácido nalidíxico (50 µg/ml) y se incubaron a 37°C por 24 horas, para luego realizar la lectura de las placas en busca de la presencia de Salmonella en los órganos y el contenido cecal. Los órganos se observaron en busca de alteraciones macroscópicas preparando además laminillas para examen histopatológico.
Resultados y Discusión
Con respecto a la presencia de Salmonella en las aves silvestres, solamente de un (Colaptes campestris - carpintero de campo (pica-pau-do-campo) se aisló S. Heidelberg de órganos y contenido intestinal. Varios autores también han aislado Salmonella de aves silvestres (Sousa et al., 2010a; Sousa et al., 2010b). Al analizar microscópicamente los órganos de este ave silvestre positiva, solamente se observó antracosis moderada difusa peribronquial.
En lo que se refiere a las muestras de pollos de engorde, de las 25 muestras de agua, dos resultaron positivas a Salmonella spp. (S. Glostrup; S. enterica subespecie. enterica 6,8:d:-), de las 36 muestras de heces de pollos, una de las cuales fue una muestra conjunta o "pool" de 10 hisopos de heces, cuatro fueron positivas a Salmonella spp. (S. Heidelberg; S. enterica subespecie enterica 6.7:R:-; S. enterica subespecie enterica 4,5,12:R:-; S. Tennessee). Entre las 47 muestras de cama, una de las cuales fue una muestra conjunta de 10 hisopos de cama, tres resultaron positivas a Salmonella spp. (S. enterica subespecie enterica 4,5,12:R:-; S. Heidelberg; S. Infantis). De las 25 muestras de insectos, una de las cuales era una muestra conjunta de 15 gramos de insectos, una resultó positiva a Salmonella spp. (S. Tennessee).
De las 15 muestras de heces de cerdos, una de las cuales era una muestra conjunta de 10 hisopos de heces, cuatro fueron positivas a Salmonella spp. De estas, 2 fueron del mismo serotipo (S. Panamá e S. Typhimurium).
En su totalidad, las 30 muestras de roedores analizadas, una de las cuales era una muestra conjunta de 20 gramos de heces, resultaron negativas al aislamiento de Salmonella spp.
También se aislaron diversos serotipos de Salmonella spp. en una investigación realizada con productos avícolas incluyendo alimento, cama y harina de carne (Hofer et al., 1998; Andreatti Filho et al., 2001).
El signo clínico observado en los pollos durante la infección experimental fue la presencia de heces blandas en el piso de las jaulas y alrededor de la cloaca, lo que sugiere un cuadro de diarrea entre los días 3 y 12 dpi. Durante el transcurso del experimento ocurrió una muerte en el grupo de S. enterica subespecie enterica 6,7:R:-. En su totalidad, los hisopos cloacales tomados de las 15 aves de cada grupo el día 1 dpi fueron positivos, excepto en el grupo de S. Panamá, en el cual dos aves no eliminaron Salmonella al momento del muestreo con hisopo. Con excepción de un ave, el grupo S. Tennessee no eliminó el agente el día 8 dpi. Los hisopos cloacales de todas las aves de los 9 grupos de Salmonella fueron positivos el día 15 dpi. Algunos autores han reportado la excreción de Salmonella spp. en las heces por tiempo prolongado (Pinheiro et al., 2001; Oliveira et al., 2005; Ribeiro et al., 2005).
La mitad de las aves se sacrificó a los 15 dpi y el resto a los 21 dpi. Durante la necropsia se tomaron asépticamente muestras con hisopo de hígado, bazo y contenido cecal para verificar de qué órganos era posible aislar Salmonella spp. A los 15 dpi los serotipos de Salmonella estuvieron presentes en el hígado y el bazo de 27 aves (20%) y en todas las muestras de contenido cecal. A los 21 dpi los serotipos de Salmonella estuvieron presentes en el hígado y el bazo de 16 (11.8%) y continuaron presentes en todas las muestras de contenido cecal. Nuestros resultados coinciden con los de Ribeiro et al. (2005) al investigar S. Kottbus en pollos de un día.
Durante la necropsia se observaron lesiones macroscópicas: palidez del hígado, manchas en el hígado, aumento de volumen del bazo, petequias en los músculos pectorales y de la pierna, principalmente con los serotipos S. Tennessee, S. Panamá, S. Glostrup y S. Infantis. En lo que se refiere a los cambios microscópicos en los órganos de los pollos infectados experimentalmente se observaron sobretodo granulocitos en el bazo y el bolsa de Fabricio, y células caliciformes en duodeno, íleon y ciego.
Conclusiones
Por medio de esta investigación fue posible aislar serotipos de Salmonella spp. de muestras tomadas en granjas de pollos de engorde y cerdos, así como de aves silvestres que frecuentan las instalaciones avícolas, mostrando la presencia d este agente en diversos materiales analizados. Cuando se inocularon a pollos de un día, estos serotipos fueron eliminados en las heces durante un tiempo prolongado, convirtiéndose así en portadores y reservorios del germen y diseminándolo al ambiente, contaminando el agua, el alimento y la cama.
Bibliografía
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Berchieri Junior A & Freitas Neto OC. 2009. Salmoneloses. pp. 435-454. In: Doenças das aves. Berchieri Junior A, Silva EN, Di Fábio J, Sesti L, Zuanaze MAF. (ed), 2.ed. Campinas: FACTA.
Davies RH & Wray C.1996. Persistence of Salmonella Enteritidis in poultry units and poultry food. Brit Poul Sci 37:589-596.
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Oliveira GH, Berchieri Junior A, Fernandes AC. 2005. Experimental infection of laying hens with Salmonella enterica serovar Gallinarum. Braz J Microbiol. 36:51-56.
Pinheiro LAS, Oliveira GH, Berchieri Junior A. 2001. Experimental Salmonella enterica serovar Pullorum infection in two commercial varieties of laying hens. Avian Pathol. 30:129-133.
Ribeiro SAM, Berchieri Junior A, Orsi MA, Mendonça AO, Ferrati AR. 2005. Experimental infection by Salmonella enterica subsp enterica serovar Kottbus in day-old broiler chickens. Braz J Poult Sci. 7(2):107-112.
Sousa E, Berchieri Junior A, Pinto AA, Machado RZ, Carrasco AOT, Marciano JA, Werther K. 2010a. Prevalence of Salmonella spp. antibodies to Toxoplasma gondii, and Newcastle disease virus in feral pigeons (Columba livia) in the city of Jaboticabal, Brazil. J Zoo Wildlife Med. 41(4):603-607.
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