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Experiencias practicas en el diagnostico de la infección de la Bolsa de Fabricio

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En las aves domésticas la competencia inmunológica es especialmente importante para el desempeño productivo de la parvada; cuando las aves están inmunocomprometidas la eficiencia productiva disminuye, la efectividad de las vacunas utilizadas rutinariamente se reduce y se incrementa la susceptibilidad hacia otros agentes patógenos Las alteraciones en los mecanismos de resistencia natural y de inmunidad pueden ser causadas por factores medioambientales adversos como temperaturas fuera de la zona de confort, densidad excesiva, restricciones alimenticias y manejo inadecuado de la parvada. Otros agentes nocivos para el sistema inmunológico son los desechos industriales y agrícolas, así como las toxinas de origen microbiológico, particularmente las producidas por los hongos. Existen además agentes infecciosos capaces de alterar la capacidad funcional del sistema inmunológico de las aves, como los virus causantes de la Infección de la bolsa de Fabricio, Enfermedad de Marek, Anemia Infecciosa Aviar, Leucosis Aviar y la Reticuloendoteliosis.

Cada uno de estos agentes inmunodepresores pueden actuar de manera individual, sin embargo, bajo condiciones de explotación comercial, se pueden presentar de manera simultánea y esto puede provocar efectos aditivos, sinérgicos y/o potencializadores adversos sobre la capacidad de respuesta del sistema inmune y sobre la productividad de la parvada.


LA INFECCION DE LA BOLSA DE FABRICIO

La Infección de la bolsa de Fabricio (IBF) ó Enfermedad de Gumboro es una enfermedad aguda altamente contagiosa de pollos jóvenes caracterizada por una destrucción severa de los linfocitos de la bolsa de Fabricio. El virus de la IBF es un virus RNA de doble banda, de la familia Birnaviridae, género Avibirnavirus. y es probablemente el virus inmunodepresor más importante de la industria avícola. Debido a que el virus es altamente resistente a las medidas convencionales de limpieza y desinfección de las casetas, una vez establecido en la granja tiende a persistir indefinidamente mientras las casetas se están utilizando.

Los pollos criados bajo condiciones comerciales tienen elevadas posibilidades de exponerse al virus de IBF en las fases más tempranas de su vida. Los efectos de la infección viral varían enormemente dependiendo tanto de las características de las aves expuestas (estirpe, edad, grado de inmunidad materna), del tipo y manejo de la explotación, así como de las características del virus infectante.

De acuerdo a su patogenicidad, el virus de IBF (VIBF) puede ser clasificado en tres grupos principales: VIBF subclinico, VIF clásico virulento y VIBF muy virulento, ya que el virus posee gran variabilidad genética que se traduce en grados variables de virulencia, según el daño que producen en la bolsa, los signos clínicos y la mortalidad. al. Gran parte de estas características están codificadas en la región hipervariable del gene de la proteína VP2 .

Las cepas de IBF subclinicas
causan inmunodepresión pero no producen signos ni causan mortalidad, Las cepas de IBF clásicas virulentas causan inmunodepresión con alta morbilidad pero baja mortalidad. Las cepas muy virulentas son cepas de tipo estándar que no presentan cambios antigénicos significativos, sin embargo, la virulencia de estas cepas esta incrementada, causan rangos elevados de morbilidad y mortalidad y las aves que sobreviven a la infección también están inmunodeprimidas. Desde 1987 se han reportado brotes agudos y muy severos de la enfermedad en Europa, Asia y África, y posteriormente en América Latina. En 1995 durante la Sesión General número 63 de la Organización Mundial de Salud Animal (OIE), el 80% de los países miembros han reportado casos muy virulentos de la enfermedad. En México el cuadro muy virulento de la Infección de la bolsa de Fabricio aún no ha sido reportadoAntigénicamente se han identificado dos serotipos, pero sólo el Serotipo 1 es naturalmente patógeno para los pollos. Dentro del Serotipo 1 existen 2 grupos principales del VIBF, los virus Estándar y los virus Variantes. En el grupo de los virus Estándar se incluyen las cepas clásicas virulentas, las cepas muy virulentas y las cepas vacunales (Figura 1).

El grupo de los virus Variantes está compuesto por cepas antigénicamente distintas que generalmente no producen signos pero causan atrofia bursal severa. Las cepas Variantes son capaces de infectar y causar enfermedad en pollos con niveles elevados de anticuerpos contra las cepas Estándar, los sueros de aves vacunadas con cepas Estándar tienen una capacidad limitada de neutralizar a las cepas Variantes. La secuenciación genética del gene de la proteína VP-2 es método más confiable para la identificación y diferenciación de las cepas del VIBF. Variantes del VIBF aisladas en Estados Unidos y Latinoamérica muestran cambios ("drifts") antigénicos que afectan la neutralización de los epitopes de la proteína de la cápside VP2. En estudios realizados en Georgia EUA, se detectó que el 80% de las cepas de Estados Unidos fueron variante tipo Delaware E y el 8% similar a Variante E; en Colombia y Ecuador se detectaron cepas similares a la variante Delaware E, en Perú y Venezuela se detectaron tipos Delaware y GLS mientras que en Brasil y Republica Dominicana se detectaron cepas clásicas de alta virulencia, de las muestras procedentes de México 6 correspondieron a cepas estándar y 3 no fueron tipificables con el sistema utilizado. En otro estudio realizado en la Universidad de Ohio, a partir de muestras procedentes de México, se encontraron cepas Variantes cercanas al grupo Delaware E, cepas clásicas virulentas y cepas variantes cercanas a cepas clásicas. Las cepas variantes prevalentes en los Estados Unidos, continúan sufriendo modificaciones genéticas.

Actualmente se han detectado diversos grupos filogenéticos, sin embargo, no se ha establecido completamente si han ocurrido cambios significativos en sus características antigénicas. Es posible que los virus detectados en América Latina fueran originados de las cepas de los Estados Unidos debido a las similitudes genéticas observadas entre ambos grupos de virus.

Figura 1.- Clasificación de las cepas de VIBF de acuerdo a su antigenicidad y a su virulencia: (Jackwood and Sommer-Wagner, 2007)
 


CUADRO CLINICO


La enfermedad tiene dos formas de presentación: clínica y subclínica, que están determinadas por la edad cuando ocurre la infección, por la virulencia de la cepa viral involucrada y por el grado de inmunidad de las aves infectadas.

En Latinoamérica y en los Estados Unidos la presentación más importante de la enfermedad ocurre como un cuadro subclínico. Esta presentación cursa con atrofia severa e irreversible de la bolsa de Fabricio, lo que genera un estado permanente de inmunodepresión que produce fallas vacunales y un incremento en la susceptibilidad hacia las enfermedades infecciosas (colibacilosis, coccidiosis, hepatitis con cuerpos de inclusión, enfermedad de Marek, etc.). La inmunodepresión que se presenta es debida a defectos en la inmunidad humoral y en la producción de anticuerpos; los efectos sobre la inmunidad celular son leves y transitorios. La gravedad del daño sobre el sistemainmune depende del momento de la vida del ave en el que ocurre la infección, entre más joven sea el ave la inmunodepresión resultante será más severa.

La forma subclínica de la IBF es producida por la infección de cepas variantes usualmente en aves menores a tres semanas de edad. Infecciones por cepas clásicas de virulencia moderada pueden también causar la forma subclínica de la enfermedad, sobre todo en aves infectadas menores a dos semanas de edad.

El diagnóstico del cuadro subclínico de la enfermedad de Gumboro basado en los signos es difícil ya que no hay signos específicos de la enfermedad; sin embargo existen indicadores generales que sugieren un problema de inmunodepresión en la parvada, como un desarrollo productivo deficiente (peso final al mercado, ganancia de peso, conversión alimenticia, índices de productividad bajos); aumento en la incidencia de complicaciones en las enfermedades respiratorias; aumento en la severidad de las reacciones post vacunales, respuestas serológicas menores a lo esperado en las vacunaciones rutinarias y aumento en la incidencia de enfermedades oportunistas( hepatitis con cuerpos de inclusión, dermatitis gangrenosa, colibacilosis).

La presentación clínica de la enfermedad de Gumboro es producida por cepas de tipo Estándar llamadas Clásicas) o por cepas de alta virulencia. Esta forma generalmente se presenta en aves de tres a seis semanas. Las aves presentan un cuadro caracterizado por diarrea acuosa y blanquecina (diuresis), anorexia, depresión y erizamiento de las plumas. Las aves afectadas con este cuadro clínico presentan lesiones en la bolsa de Fabricio características. En los estadíos iniciales de la enfermedad se observa un aumento de tamaño de la bolsa, seguido de un edema acuoso marcado en la serosa, edema que más tarde se torna gelatinoso y de un color amarillento. En los casos avanzados de la enfermedad, la bolsa puede presentar algunas hemorragias. Pueden observarse hemorragias en la musculatura de las extremidades inferiores.

Los cuadros muy severos de la enfermedad son producidos por cepas de Tipo Estándar denominadas "Muy Virulentas" y se caracterizan por provocar un aumento súbito y severo de la mortalidad, que puede alcanzar niveles tan elevados como del 70%. En las etapas finales de la enfermedad es común observar tremores, postración; deshidratación severa e hipotermia. En estos casos la bolsa de Fabricio presenta hemorragias severas que se pueden observar tanto en la mucosa como en la serosa de la bolsa (Figura 2), Las hemorragias también se observan de forma generalizada en la musculatura de las extremidades inferiores y en algunos casos en la pechuga.
Otras lesiones frecuentes son nefritis, nefrosis y deshidratación.

Figura 2- Hemorragias severas en la mucosa bursal por infección por un virus muy virulento de la Infección de la bolsa de Fabricio (Villegas y Banda, 2006)..


EL DIAGNOSTICO DE LA INFECCION DE LA BOLSA DE FABRICIO.

El uso del laboratorio es esencial para el diagnóstico de la Infección de la bolsa de Fabricio y para la evaluación de los programas de protección contra la enfermedad. Para que los estudios de laboratorio sean efectivos, deben ser constantes, es probable que los cambios en elcomportamiento de las parvadas que se observan por cambios en la vacunación contra IBF no
sean ni drásticos ni inmediatos en la primer parvada, sino que más bien se establecen en forma gradual y progresiva. La interpretación de un solo grupo de resultados es difícil y puede conducir a conclusiones erróneas.

No es necesario hacer un estudio extensivo a un gran número de aves, pero si es muy importante que las aves a analizar sean representativas del estado general de la parvada, la representatividad de los resultados depende en gran medida de la representatividad de las muestras colectadas. Se requiere también que la metodología del muestreo sea constante.

Es preferible usar el mismo laboratorio y que se usen las mismas técnicas, los mismos reactivos y personal constante para minimizar los errores atribuibles a los procedimientos utilizados. Las técnicas usadas deben estar estandarizadas y dar resultados que se puedan cuantificar, además deben ser prácticas, accesibles y no ser demasiado costosas; las ventajas que se deberán obtener con su uso deberán ser superiores a los costos que implica el uso del Laboratorio de Diagnóstico.

En términos generales, las técnicas de diagnóstico son las siguientes:
a) Aislamiento viral in vitro.
b) Aislamiento viral in vivo.
c) Detección de antígenos virales en la bolsa.
d) Serología.
e) Histopatología.
f) Biología molecular.

a) Aislamiento viral in vitro.
El virus de IBF está presente en la mayoría de los órganos linfoides, sin embargo en la bolsa de Fabricio es donde se encuentra en mayor cantidad y por mas tiempo, asi que es la muestra de elección para realizar el aislamiento viral. El VIBF puede ser aislado in vitro por inoculación en embriones de pollo libres de anticuerpos contra el VIBF. La membrana corioalantoidea (MCA) es la vía de inoculación más efectiva aunque el virus también puede ser aislado inoculando por vía del saco vitelino (SV). Las lesiones embrionarias y la mortalidad tras la inoculación varían de acuerdo al patotipo de virus aislado. Las cepas clásicas inoculadas por MCA producen muerte embrionaria en 3 a 5 días y los embriones presentan congestión y hemorragias petequiales en los folículos de las plumas, las articulaciones de los dedos y en el área cerebral; el hígado puede presentar necrosis. Las cepas variantes pueden crecer cuando son inoculadas por vía CAM pero no producen muerte embrionaria, por lo que los embriones deben ser revisados 7 días después de la inoculación para detectar edema cerebral y abdominal de color blanquecino, enanismo y focos de necrosis en el hígado, los embriones no presentan congestión o hemorragias. Aunque el aislamiento inicial del virus es mejor por inoculación en embrión de pollo, el virus puede ser adaptado a cultivo celular y crecer en líneas celulares embrionarias de bolsa de Fabricio, células renales y fibroblastos,
produciendo efectos citopáticos. El aislamiento viral in vitro no es una prueba frecuentemente utilizada para el diagnóstico de IBF.

b) Aislamiento viral in vivo.
Una alternativa para facilitar el aislamiento viral es la inoculación de aves sin anticuerpos anti VIBF de 3 semanas de edad con un macerado de tejido bursal sospechoso administrado por vía oral. El cuadro clínico se reproducirá en las aves de 3 a 5 días post inoculación y las bolsas de estas aves pueden ser usadas para la inoculación de embriones de pollo libres de anticuerpos anti VIBF.

c) Detección de antígenos virales en la bolsa.Una manera rápida de detección del virus de IBF es la demostración de antígenos virales en la bolsa.de Fabricio. Existen pruebas de inmunofluorescencia directa e indirecta y de 

inmunohistoquímica que han demostrado su eficacia, aunque la disponibilidad de los antisueros marcados puede ser una limitante. Es posible la realización de una prueba de precipitación en agar para demostrar la presencia del virus utilizando un macerado de bolsas de aves en la fase aguda de la enfermedad y enfrentándolo a un antisuero conocido contra el VIBF. Existe también un sistema de ELISA de captura de Antígeno que ha sido utilizado para la detección y la caracterización del VIBF a partir de macerado de tejido bursal. 

d) Serología.
La serología es un área importante de investigación de la enfermedad y existen varias técnicas disponibles para la cuantificación de los anticuerpos en el suero. Actualmente las pruebas de ensayo inmunoenzimático (ELISA) y de virus suero neutralización (VSN) son las más utilizadas.
La prueba de ELISA es la prueba más usada en los laboratorios de diagnóstico. La prueba de ELISA no es específica de serotipo y detecta anticuerpos tanto del serotipo 1 como del serotipo 2 y no permite la diferenciación de anticuerpos contra diferentes subtipos antigénicos ya que utiliza virus completos como antígenos. Los resultados de la prueba de ELISA no siempre están correlacionados con los de la prueba de VSN. La prueba de ELISA tiene las ventajas de ser rápida, relativamente fácil de hacer y requiere de cantidades mínimas de suero para su realización, así mismo, permite que los resultados sean fácilmente exportables a un software que permite fácilmente almacenar y organizar los resultados en una base de datos, para hacer comparaciones y análisis estadísticos. Existen varios estuches disponibles comercialmente para la realización de la
prueba

El uso generalizado de la técnica de ELISA permite conocer el perfil serológico esperado de las parvadas y establecer los parámetros normales o "líneas de base", por medio de estudios estadísticos de los resultados a través del tiempo, de acuerdo a las características propias de cada empresa. Esta información puede clasificar los muestreos particulares como altos, normales o por debajo del nivel esperado de anticuerpos en la parvada (Figura 3) .En análisis de los resultados de la prueba de ELISA permite analizar el desempeño de los esquemas de vacunación, determinar la magnitud de la exposición hacia virus de campo; predecir los niveles de inmunidad materna en la progenie y determinar la edad más adecuada para la primera vacunación, generalmente los títulos serológicos de la progenie recién nacida son un 60-80% mas bajos que en las reproductoras de origen. Después del nacimiento, los niveles de anticuerpos son variables dependiendo de la edad de las aves e indican cual ha sido la respuesta serológica hacia el virus. No necesariamente pueden indicar por si solos un nivel de protección, particularmente en aves mayores de tres semanas. Un título elevado de anticuerpos puede indicar buena protección o bien evidenciar un fuerte desafío de campo y que las aves no han resistido dicho desafío.

Figura 3.- Perfil de anticuerpos contra el VIB en reproductoras comerciales en producción, en 3 edades (Valladares y col. 2009).
 

La prueba de virus suero neutralización es el método más sensible para la detección de anticuerpos contra el VIBF. La prueba se realiza en un sistema de micro titulación usando como antígeno un virus adaptado al crecimiento en cultivo celular y fibroblastos de embrión de pollo. La prueba de VSN es cuantitativa y es la única prueba serológica que puede ayudar a diferenciar entre diferentes serotipos y subtipos antigénicos del VIBF. La mayoría de los sueros de los pollos en condiciones de campo tienen un nivel elevado de anticuerpos neutralizantes contra un amplio espectro de virus antigénicamente diversos debido a la combinación de exposiciones de campo, exposiciones vacunales y a las reacciones cruzadas que se observan cuando el nivel de anticuerpos es elevado.
La realización de la prueba de VSN es compleja, relativamente costosa, consume mas tiempo y no permite la evaluación de una gran cantidad de sueros de manera simultánea..La prueba de precipitación en agar (AGP) puede ser usada para la detección y cuantificación de
anticuerpos en aves convalecientes, pero su sensibilidad es baja.

Ninguna de las pruebas serológicas disponibles actualmente pueden tipificar de manera precisa y contundente el tipo de cepa que afecta a las aves en el campo.

e) Histopatología.
El tejido blanco del VIBF es la bolsa de Fabricio, el estudio histológico de la bolsa permite determinar el grado de lesión que tiene la bolsa después de una infección. Si bien, las lesiones bursales no son exclusivas de las infecciones por el VIBF, son bastante características, predecibles y tienen un elevado grado de correlación con los patotipos del virus. La intensidad de las lesiones bursales es un reflejo del grado de protección de las aves ante un desafío de campo, particularmente del tejido linfoide bursal, que es el tejido funcional de la bolsa.

Si bien los estudios histopatológicos son fundamentalmente descriptivos, algunos investigadores han desarrollado sistemas semicuantitativos con escalas arbitrarias de evaluación del daño bursal, para hacer comparaciones entre diversos casos, con criterios particulares de cada investigador. La evaluación histológica debe incluir tanto la extensión del tejido dañado (distribución de la lesión), así como el intensidad de la lesión sobre el tejido linfoide. El curso de la lesión es importante para determinar la duración del proceso y la etapa de la infección viral.

Nosotros hemos desarrollado un sistema de evaluación de las lesiones microscópicas bursales.
Las lesiones son identificadas y descritas con cuatro criterios principales : tipo de lesión, curso de la lesión, distribución e intensidad. Posteriormente las lesiones son calificadas en una escala numérica a los criterios de distribución (como proporción de tejido afectado) y de intensidad (severidad) tomando como criterio principal el estado del tejido linfoide bursal. En este sistema se evalúa cada bolsa en un corte transversal por su eje mayor, teñido con una coloración convencional de Hematoxilina & Eosina (Figura 4). Se recomienda la observación de muestras de por lo menos 10 aves de la misma parvada, seleccionadas al azar. La observación de las muestras se realiza individualmente. El promedio de la evaluación de las 10 bolsas se denomina "Grado de Lesión Linfoide Bursal"

Figura 4.- Corte histológico de bolsa de Fabricio para la determinación del "Grado de Lesion Linfoide Bursal"(Valladares, 2007)


La escala arbitraria del "Grado de lesión Linfoide Bursal" es de 0 a 7; donde valores de 0 se consideraron sin lesiones, valores entre 0.1 y 2.5 como lesiones leves, valores mayores de 2.6 y menores de 6 como lesiones moderadas y valores entre 6 y 7 se consideraron lesiones severas. De acuerdo al siguiente criterio.

A.- Tipo de lesión y Curso de la lesión:
El tejido linfoide bursal tiene una capacidad relativamente estrecha para responder a la agresión, los cambios mas importantes son:

a) afectaciones en la densidad celular, que usualmente se refieren a una disminución de la densidad de los linfocitos en los folículos linfoides, esta lesión se conoce como depleción linfoide (del ingles "depletion" = disminución, reducción, merma). La depleción linfoide usualmente se inicia en la zona medular y posteriormente afecta a la zona cortical; la disminución en el número de células linfoides se manifiesta por baja celularidad, aspecto vacuolar del tejido y/o por la presenciade células reticulares que usualmente no son visibles en los cortes de los tejidos sin lesiones. La intensidad de la lesión es generalmente de leve a moderada.

Eventualmente se observan cambios adaptativos en la densidad celular con un incremento en el tamaño folicular por aumento del número de linfocitos en un folículo individual, a esta lesión se le denomina hiperplasia folicular y usualmente es compensatoria a una destrucción extensa del tejido linfoide. La intensidad de la lesión puede ser de leve a moderada.

b) daño en la integridad del tejido linfoide, con muerte y destrucción de linfocitos. Esta lesión se denomina necrosis linfoide y su distribución puede ser focal, extensiva o difusa. La intensidad de la lesión suele ser de moderada a severa.
c) Inflamación del tejido bursal, es una respuesta que se observa tras una agresión severa, se denomina Bursitis y de acuerdo a sus características histológicas puede ser hiperaguda , aguda, subaguda o crónica, Las lesiones hiperagudas y agudas se caracterizan por cambios vasculares como edema que inicia siendo subepitelial y posteriormente se extiende hacia los espacios interfoliculares; congestión y hemorragias, que se localizan preferentemente en las puntas de las plicas; los casos más severos se caracterizan por marcada infiltración heterofila; la lesión tisular más importante es la necrosis linfoide. En las lesiones subagudas los cambios vasculares son menos evidentes; la necrosis linfoide empieza a ser sustituída por las células del estroma subyacente y se inician los cambios de reparación que pueden ser regenerativos o fibrosantes,
dependiendo de la gravedad del proceso. El cuadro crónico se caracteriza por atrofia del tejido linfoide, proliferación del tejido conjuntivo interfolicular y proliferación del epitelio superficial y ocasionalmente del epitelio corticomedular, dando en ocasiones un aspecto adenoide a la bolsa. La bursitis crónica se considera irreversible cuando se pierde totalmente la arquitectura de los folículos linfoides y no hay posibilidad de regeneración, los folículos se pierden permanentemente; ocasionalmente la arquitectura folicular no se pierde por completo y se puede observar la regeneración de algunos folículos, particularmente los que están localizados en la base de las plicas, sufriendo éstos una hiperplasia compensatoria. La inflamación del tejido bursal generalmente se presenta en forma difusa pero también puede ser extensiva. La intensidad de la lesión es de moderada a severa.

Los términos patológicos hiperagudo, agudo, subagudo y crónico son términos descriptivos para caracterizar a la lesión, de acuerdo la respuesta vascular y tisular que se observan tras la agresión.
Estos términos no necesariamente corresponden al criterio clínico de agudo y crónico.
El tipo de Lesión y el Curso de la lesión son términos descriptivos para caracterizar a la lesión y se utilizan para obtener el diagnóstico histológico.
La cuantificación numérica para obtener el "Grado de Lesión Linfoide Bursal"., toma en cuenta los criterios de distribución y la intensidad de la lesión.

B. Distribución: La distribución de las lesiones puede ser focal, multifocal, extensiva o difusa y considera la proporción del tejido afectado con respecto a la superficie total observada.

Para la determinación del "Grado de Lesión Linfoide Bursal" la proporción del tejido afectado puede tener un valor un valor numérico arbitrario de 0 a 4, según la proporción de los folículos afectados, donde:
0 = sin lesiones
1 = hasta un 25% de los folículos afectados
2 = hasta un 50% de los folículos afectados 3 = hasta un 75% de los folículos afectados, y 4 = hasta un 100% de los folículos afectados C. Intensidad de la lesión: La Intensidad de la lesión está determinado por el nivel de destrucción de los linfocitos de los folículos linfoides; puede ser nulo, leve, moderado o severo.

Para la determinación del "Grado de Lesión Linfoide Bursal" la Intensidad de la lesión puede tener un valor arbitrario de 0 a 3 donde:
0 = sin lesiones
1 = leve, existe disminución de la densidad celular y del número de células linfoides de los folículos, o bien la presencia de necrosis en algunos linfocitos de la zona medular.
2 = moderado, existe desaparición celular y necrosis individual de linfocitos, pero la arquitectura celular básica de los folículos es mantenida; generalmente se observan otros cambios tisulares indicativos de un proceso inflamatorio, ya sea agudo o subagudo (congestión vascular y edema).
3 = severo, la arquitectura de los folículos se pierde, la necrosis es extensiva y abarca tanto a la zona medular como a la zona cortical, el estroma del tejido está también afectado, los cambiosinflamatorios son severos y su naturaleza varía de acuerdo al curso del proceso y la inflamación
puede ser aguda o crónica.

La determinación del "Grado de Lesión Linfoide Bursal" se obtiene para cada una de las bolsas analizadas sumando los valores obtenidos con la Distribución y con la Intensidad de la Lesión, en una escala continua de 0 a 7, donde 0 es el valor mínimo y 7 es el valor máximo. Y resulta de la suma de las evaluaciones de Distribución e Intensidad de la lesión.

Distribución (escala de 0 a 4) + Grado (escala de 0 a 3)
Se recomienda hacer este estudio en por lo menos 10 aves exactamente de la misma edad, Se obtiene un diagnóstico morfológico microscópico describiendo la lesión predominante de cada bolsa con distribución, curso, grado y proporción del total muestreado, indicando el número de bolsas que presentan dicha lesión. Finalmente se obtiene el Grado de Lesión Linfoide Bursal" con el promedio aritmético del total de observaciones.

La interpretación del Grado Promedio de Lesión Linfoide Bursal es la siguiente:
SIN LESION 0
GRADO DE LESION LEVE: de 0.1 a 2.5
GRADO DE LESION MODERADA: de 2.6 a 5.9
GRADO DE LESION SEVERA: de 6.0 a 7.0

Ejemplo:
Diagnóstico histopatológico: sin lesiones 2/10; depleción linfoide medular, difusa, moderada 3/10;
bursitis aguda, difusa, severa 5/10.

Evaluación cuantitativa::
- sin lesiones (distribución 0% = 0), (intensidad = 0): 0 x 2 bolsas = 0
- depleción linfoide medular, multifocal ( distribución 50%= 2), moderada(intensidad = 1.5):
2 + 1.5 = 3.5 x 3 bolsas = 9.5
- bursitis aguda, difusa: (distribución 100% = 4) severa (intensidad = 2.8)
4 + 2.8 = 6.8 x 5 bolsas = 34
Grado Promedio de Lesión Linfoide Bursal = 0 + 9.5 + 34 = 43.5/10 = 4.35 el promedio del grado de lesión bursal es 4.35, lo que clasificaría al grado de agresión bursal como moderado, donde 5 bolsas estaban muy lesionadas, 3 bolsas tenían lesiones leves y 2 bolsas no tenían lesiones.

Interpretación del Grado de Lesión Linfoide Bursal:
El grado de lesión linfoide bursal puede ser indicativo del nivel de protección de la parvada contra la Enfermedad de Gumboro. Entre menor sea el grado promedio de lesión bursal detectado, se interpreta como un mayor protección contra los desafíos de campo (o bien que no ha habido fuertes desafíos de campo en la granja).

Es difícil encontrar grados de lesión de 0 sobre todo en aves mayores de 4 semanas. Las observaciones realizadas hasta una semana después de una vacunación con un virus vivo normalmente resultan en grados promedio de lesión menores a 2. Una parvada bien protegida tendrá grados promedio de lesión bursal menores a 3.5 por lo menos hasta la 5ª semana de edad, después de la 6ª semana el grado promedio de lesión bursal tiende a elevarse progresivamente, normalmente hasta un valor de 4. Grados promedio de lesión bursal superiores a 6 indican una
agresión severa sobre el tejido bursal y denotan que el desafío de campo ha logrado superar el grado de protección del sistema inmune hacia el virus de Gumboro; en estos casos es muy importante detectar la edad a la que estas lesiones están siendo detectadas; las lesiones agudas
tardan aproximadamente 4-5 días en desarrollarse por lo que 4-5 días antes de la detección de la lesión aguda es cuando el desafío de campo ha superado la barrera inmunológica; entre más tardío sea este cambio denotará una mejor protección de la parvada.

En un estudio de tres años de duración se analizaron 26,100 muestras de tejido bursal de pollo de engorda muestreados semanalmente desde la 2° hasta la 6° semana de edad; los estudios histopatológicos indican que la infección se establece en las parvadas entre la tercera y la cuarta semana de edad y tienen un nivel máximo de lesión alrededor de la 5° semana de edad (Figura 5).

Figura 5.- Grado de Lesión Linfoide Bursal durante 2006, 2007 y 2008 en 26,100 muestras de pollo de engorda de 2° a 6° semana de edad (Valladares y col. 2008)


Correlación de los hallazgos histopatológicos con los resultados de serología: la interpretación de los resultados es mas precisa si se utilizan varias pruebas, como la serología y la histopatología. 

Una vez que se ha establecido este sistema de Monitoreo y se conocen las características de la Enfermedad de Gumboro en una zona determinada, el sistema puede usarse para establecer diferencias entre los diferentes calendarios de vacunación o entre los diferentes productos a utilizar para la protección de los pollos de engorda. 

En otro estudio se compararon los resultados de serología e histopatología durante 1 año de 2 empresas con calendarios de vacunación diferentes. La empresa A tenía parámetros productivos buenos de acuerdo a la zona, mientras que la empresa B tenía parámetros productivos deficientes de acuerdo a la zona.

En la empresa A se hicieron 320 estudios en un lapso de un año. El título promedio para IBF en pollos de 1 a 3 días fue de 3608 (CV 36%), en la 4º semana el título promedio fue de 225 (CV 24%), en la 6ª semana el título promedio fue de 3469 (CV 52%), El grado promedio de lesión bursal fue 0.25 en los primeros 3 días, 2.2 en la 4ª semana y 5.4 en la 6º semana, donde el predominio de las lesiones fue la bursitis aguda. 
En la empresa B se hicieron 285 estudios en un lapso de un año. El título promedio para IBF en pollos de 1 a 3 días fue de 4032 (CV 46%), en la 4° semana el título promedio fue de 526 (CV 172%), en la 6ª semana el título promedio fue de 3826 (CV 49%). El grado promedio de lesión bursal fue de 0.18 en los primeros 3 días, 4.9 en la de 4ª semana donde el predominio de las lesiones fue bursitis aguda difusa de moderada a severa y 6.7 en la 6º semana, donde el predominio de las lesiones fue la bursitis crónica. 
Aunque los resultados de serología son aparentemente similares en ambos casos, la empresa A tuvo lesiones leves a la 4° semana y lesiones moderadas a la 6° semana, mientras que la empresa B tuvo lesiones moderadas a la 4° semana y lesiones severas a la 6° semana. lo que indica que la empresa A tuvo un nivel de protección del tejido bursal mas efectivo por lo menos durante dos semanas (Cuadro 1).


Cuadro 1.- Resultados de serología e histopatología de dos empresas con calendarios de vacunación diferentes para IBF. (Valladares, datos no publicados)

1Cada estudio consistió en muestreo de 10 aves colectadas al azar
2Synbiotics Corp
3Valladares, J.C. 2007

En otro estudio se compararon dos vacunas vivas en un calendario comercial en una granja de 72,000 aves. El calendario de vacunación consistió en Enfermedad de Marek e IBFpor vía subcutánea al primer día y una revacunación contra IBF el día 14 en el agua de bebida, usando dos productos diferentes ( A y B ), Se realizaron estudios de ELISA e histopatología de la bolsa de Fabricio semanalmente. La Vacuna A indujo lesiones moderadas (3.4) 5 días después de su aplicación, el calendario protegió por lo menos hasta la 4ª semana, en la 6ª semana hubo lesiones crónicas moderadas con un inicio en la elevación de los títulos, para la 8ª semana las lesiones presentaron cierta regresión. La vacuna B indujo lesiones leves (1.30) 5 días después de su aplicación, el calendario protegió, por lo menos hasta la 6ª semana, resultando el muestreo sin lesiones y sin seroconversión, para la 8ª semana se observaron lesiones crónicas severas (6.40) y seroconversión. Los parámetros productivos fueron mejores con la vacuna B que con la vacuna A.

Cuadro 2.- Resultados de serología e histopatología en una granja con dos calendarios de vacunación contra IBF. (Valladares, datos no publicados)

1Cada estudio consistió en muestreo de 10 aves colectadas al azar
2Synbiotics Corp
3Valladares, J.C. 2007

f) Biología Molecular.
La detección y tipificación de las cepas del VIBF es importante para establecer las bases de los programas de control de la enfermedad y para determinar, por ejemplo, si los calendarios de vacunación utilizados pueden proteger contra los subtipos de virus presentes en el medio ambiente de las aves. Actualmente las pruebas de biología molecular son las mas más precisas para la identificación y caracterización de las cepas del VIBF.
En varios laboratorios se utiliza la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa acoplada a Retrotranscriptasa (RT-PCR) para detectar la presencia del virus en el tejido bursal. Después de confirmar la presencia del virus, este se puede tipificar utilizando las pruebas del Polimorfismo de la Longitud de los Fragmentos de Restricción (RFLP) y la prueba de Secuenciación genética de la región hipervariable del gene VP-2.

La prueba de RFLP fue de gran utilidad durante la última década, y clasifico a las cepas en grupos moleculares, sin embargo con el tiempo se fueron detectando cepas que no podían ser clasificadas adecuadamente con este sistema (Figura 6). 

Figura 6.- Clasificación de las cepas del VIBF en grupos moleculares con la prueba de RFLP (Jackwood, D. J. and Sommer, S. E. (1997).


En muestras procedentes de México estudiadas en la Universidad de Georgia, con este sistema, 6 muestras correspondieron a cepas estándar y 3 no fueron tipificables (Banda y col, 2003). En otro estudio realizado en la Universidad de Ohio, a partir de muestras procedentes de México, seencontraron cepas Variantes cercanas al grupo Delaware E, cepas clásicas virulentas y cepas variantes cercanas a cepas clásicas (Cookson y col. 2007).
En otro estudio realizado con muestras del noreste de México (Valladares y Banda, 2003) se identificaron nueve virus con un patrón idéntico al de la cepa variante Delaware E, tres virus similares a la cepa vacunal ST-12, dos virus similares a la cepa vacunal PBG y un virus no tipificable.

La variabilidad genética que se ha detectado en las cepas del VIBF no puede ser apreciada en su totalidad usando RFLP y la tendencia actual es la utilización de la secuenciación genética de la región hipervariable del gene de la proteína VP-2 (hvVP2), siendo este método el más preciso en la actualidad. La secuenciación genética permite además hacer el análisis filogenético de las cepas.

La región hvVP2 controla la antigenicidad y es parcialmente responsable del control de la patogenicidad de las cepas del VIBF. Las cepas clásicas y las cepas variantes están localizadas en dos ramas diferentes del análisis filogenético de hvVP2; este análisis también puede identificar a las cepas muy virulentas del VIBF, aunque la diferenciación entre cepas subclinicas y clínicas no es del todo clara. En la figura 7 se observa la relación filogenética de varias cepas del VIBF detectadas en Latinoamérica.

Figura 7.- Relación filogenética de cepas del VIBF procedentes de Latinoamérica (Villegas y Banda 2007)

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Durante el año 2008 se estudiaron muestras de 30 granjas de pollo de engorda del noreste de México, para identificar y tipificar los virus de IBF, evaluar las lesiones histológicas bursales y la producción de anticuerpos detectados por ELISA, asi como su relación con los calendarios de vacunación utilizados (Valladares y col. 2008).

Con la prueba de RT-PCR se detectaron 28 VIBF. El análisis de las secuencias de nucleótidos determinó que 21 virus mostraron características genéticas de los virus variantes Tipo Delaware E.
El análisis filogenético de la región hvVP2 indico que estos virus son genéticamente similares al virus 11153 USA, que fue aislado en Georgia, USA en el año 2001 (Figura 8). La secuenciación genética de los virus detectados indica que pertenecen al Grupo Molecular 6 de la clasificación

realizada por Jackwood y Sommer-Wagner (2007). El estudio histopatológico mostró que en las muestras de trece de estas granjas se observaron lesiones bursales severas, en cuatro granjas se presentaron lesiones moderadas, en dos granjas se observaron lesiones leves y en dos granjas no se detectaron lesiones bursales. Se detecto seroconversión al VIBF en 11 de estas 21 granjas, únicamente en aves a partir de la 4° semana de edad, mientras que en las 10 granjas de aves menores a 4 semanas, positivas a virus Variante, no se detecto seroconversión al VIBF. Los virus variantes se detectaron en granjas con 4 calendarios de vacunación diferentes con cepas vacunales estándar de tipo intermedio (Cuadro 3).

Figura 8.- Relación filogenética de VIBF Variante detectados en el noreste de México en 2008. (Valladares y col. 2009)

 Para ampliar la imagen haga CLICK SOBRE ELLA

Cuadro 3: Identificación de cepas variantes del VIBF en pollo de engorda en el noreste de México en 2008. (Valladares y col. 2009)

1. 1° vacuna día 4, 2° vacuna día 16, ambas por vía oral en agua de bebida.
2. RT-PCR y Secuenciación de la región hipervariable del gene VP2
3. Escala arbitraria de grado de lesión linfoide bursal de 0 a 7
4, Negativo a la identificación de VIBF por RT-PCR


RECOMENDACIONES

Existen diversos métodos para realizar el diagnóstico de la Enfermedad de Gumboro. Cada metodología posee ventajas y limitaciones. La detección e identificación de las cepas del VIBF es importante para establecer estrategias de prevención y control de la enfermedad y que los calendarios de vacunación utilizados sean capaces de proteger contra los subtipos de virus presentes en el medio ambiente de las aves.


BIBLIOGRAFIA
1) Banda, A., P. Villegas, J. El-Attrache, and C. Estévez: Molecular Characterization of Seven Field Isolates of Infectious Bursal Disease Virus Obtained from Commercial Broiler Chickens. Avian Diseases, 45, (3), 620-630, 2001.
2) - Banda, A., P. Villegas, A and J. El-Attrache, Molecular Characterization of Infectious Bursal Disease Virus from Commercial Poultry in the United States and Latin America Avian Diseases 47:87-95, 2003
3)-Cookson, K, Tamayo, M. and Jackwood, D.: Phylogenetic analysis of very virulent, classic and variant infectious bursal disease virus from central and south America, 56° Western Disease Conference, 115-117, Las Vegas, USA, 2007
4) Domanska, K., Mato, T., Rivallan, G., Smietanka, K., Minta, Z., de Boisseson, C., Toquin, D.,
Lomniczi, B., Palya, V. Eterradossi, N.: Antigenic and genetic diversity of early European isolates of Infectious bursal disease virus prior to the emergence of the very virulent viruses: early European epidemiology of Infectious bursal disease virus revisited?. Arch. Virol. 149: 465-480, 2004.
5) Instructivo de uso Synbiotics Corporation, Gaithersburg Maryland, USA.
6) Ismail, N. M., Y. M. Saif, W. L. Wigle, G. B. Havenstein, and C. Jackson: Infectious bursal disease virus variant from commercial leghorn pullets. Avian Diseases. 34:141-145, 1990.
7) Jackwood, D. J. and Sommer, S. E. (1997). Restriction fragment length polymorphisms in the VP2 gene of infectious bursal diseases viruses. Avian Diseases 41, 627-637.
8).Jackwood, D.: Recent trends in the molecular diagnosis of infectious bursal disease viruses. Anim. Health Res. Rev.: 5(2):313-316, 2004.
9) Jackwood, D. J. and Sommer-Wagner, S. E. (2007) Genetic characteristics of infectious bursal disease viruses from four continents. Virology 365, 369-375.
10) - Letzel, T., Coulibaly, F., Rey, F., Delmas, B., Jagt, E., van Loon, A. and Mundt. E.: Molecular and Structural Bases for the antigenicity of VP2 of infectious bursal disease virus, Journal of Virology, (81)32: 12827-12835, 2007.
11) Lin, Z., Kato, A., Otaki, Y., Nakamura, T., Saamaz, E. & Ueda, S.:Sequence comparison s of a highly virulent infectious bursal disease virus prevalent in Japan. Avian Diseases, 37, 315-323. 1993.
12) Liu, H., Giambrone, J.J. & Dormitoroi, T. (1994). Detection of genetic variations in serotype I isolates of infectious bursal disease virus using polymerase chain reaction and restriction endonucleas e analysis. Journal of Virological Methods, 48, 281- 291.
13) Lukert P and Saif, M: Infectious bursal disease, in Diseases of Poultry, Chapter 3. Eleventh edition, 2003, editor in Chief Y.M. Saif, Iowa State Press.
14) Rosenberger, J. K., S. S. Cloud, and A. Metz: Use of infectious bursal disease virus variant vaccines in broilers and broiler breeders, Proceedings of the 36th Western Poultry Disease Conference. University of California, Davis, CA. 106-109, 1987
15) Schnitzler, D, Bernstein, F., Miller, H. and Becht, H.: The genetic basis for the antigenicity of the VP2 protein of the infectious bursal disease virus. Journal of General Virology (74), 1563 1571, 1993.
16) Valladares, J.C.: Manual de Procedimientos Técnicos de Laboratorio, Laboratorio de Control de Calidad y Patología Aviar, PAPSA, México, 2007.
17) Valladares, J.C., Palya, V., Etcharren, L., Banda, A, Juárez, D, Barrientos, B. Angulo, E., Lara, A., Escobedo, G, Ondarza, A. y Morfin, R: Caracterización genética de cepas de campo del virus de la Infección de la bolsa de Fabricio detectadas en granjas de pollo de engorda en el estado de Nuevo León, en XXXIV Convención Nacional de la Asociación Nacional de Especialistas en Ciencias Avícolas de México, A. C., Acapulco, Guerrero, 12-15 de agosto de 2009.
18) Villegas, P. y A. Banda: Enfermedad infecciosa de la bolsa: Diferencias entre las cepas del virus, diagnóstico y prevención. Memorias del XI Seminario Internacional de Patología y Producción Aviar The University of Georgia- AMEVEA Athens, GA, 2006
19) Wu, C., Rubinelli, P. and Lin, T.: Molecular detection and differentiation of infectious bursal disease virus. Avian Diseases 51(2): 515-526, 2007.


Presentado en la Asociación de Especialistas en Ciencias Avícolas del Centro de México (AECACEM) Tercera reunión 03-03-2010

 
Autor/es
Mexico, México
Medico Veterinario Zootecnista, Maestro en Ciencias en Microbiología
(9973)
(5)
Edwin Coral Coral
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Azogues, Canar, Ecuador
Ing. Zootecnista
Re: Experiencias practicas en el diagnostico de la infección de la Bolsa de Fabricio
13/04/2010 | Me parece muy interesante su tabajo, Doctor

Es de suma importancia tener parvadas de pollos con un control de vacunación, para asi, evitar posibles brotes.

Mi pregunta es, si nosotros tenemos unos pollos BB de reproductoras vacunadas contra IBF, a que dias se puede vacuna para para no repercutis negativamente con los titulos maternales o inmunidad pasiva

o si, no se sabe el calendario de vacunación de las reproductoras, como seria la vacunación, a los 6 días y revacunar a los 14 o simplemente a los 6 días
o vacunar únicamente a los 14 días.

Claro, entendiendo que un programa de vacunaciones muy severo podría debilitar inmunitariamente al ave

gracias

Edwin Coral Coral

Ing. Zootecnista

Universidad de Nariño. Colombia
(1)
(0)
Francisco Aspée
down arrow
Melipilla, Region Metropolitana, Chile
Médico Veterinario
Re: Experiencias practicas en el diagnostico de la infección de la Bolsa de Fabricio
14/04/2010 | Dr. Valladares:

Lo felicito por su articulo, es siempre muy grato leer un articulo de quien está en contacto estrecho con la realidad de terreno.
¿Tienes experiencia con variantes A ?, hace un tiempo diagnosticamos este tipo de virus, pero al parecer no tiene un gran impacto sobre las aves.
¿ Cual es tu opinión ?

Atentamente

Dr. Francisco Aspée B.
(0)
(0)
Rafael Osorio Agudelo
down arrow
Pereira, Risaralda, Colombia
Ing. Zootecnista
Re: Experiencias practicas en el diagnostico de la infección de la Bolsa de Fabricio
15/04/2010 | Muy interesante e importante artículo, a la vez actualizado y con un contenido actualizado y real con respecto a los trabajos de campo y estudios en laboratorio.
Mi pregunta es ¿la vacunación contra gumboro es esencial en cualquier parte del mundo? ¿Cuántas aplicaciones y a que edad pueden ser las mas convenientes, donde no se afecte la inmunidad de las aves?, claro está me imagino que eso va en el grado de amenaza de los sectores.

Gracias

RAFAEL OSORIO AGUDELO
Zootecnista Colombia
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Re: Experiencias practicas en el diagnostico de la infección de la Bolsa de Fabricio
16/04/2010 | Estimados Foristas

Agradecer al Dr. Valladares por su información ordenada y sustentada adecuadamente, solo resaltar son 2 puntos que me parecen vitales de esta enfermedad.

Primero como acertadamente menciona en el articulo “que la prueba de ELISA no es específica de serotipo y detecta anticuerpos tanto del serotipo 1 como del serotipo 2 y no permite la diferenciación de anticuerpos contra diferentes subtipos antigénicos ya que utiliza virus completos como antígenos” , esto nos pude inducir en una situación de parálisis, al no hacer la tificacion correspondiente y por lo tanto insistir en nuestro programa de vacunación tradicional, y que por tanto podemos estar dejando pasar como desapercibidos infecciones sub clínicas por un diagnostico incompleto..

En segundo lugar en la figura 3 Perfil de anticuerpos contra el VIB en reproductoras comerciales en producción, en 3 edades (Valladares y col. 2009). Debo decir que es frecuente que la literatura, acote que la titulación para gumboro en reproductoras tiene una declinación importante a partir de las 40 semanas, por ello recomiendan en algunos casos la revacunación en producción, pero la realidad que he podido comprobar en algunas granjas de diferente ubicación geográfica. Que los títulos en realidad tienen este comportamiento (figura 3), es decir de incremento a mayor edad. Esto puede darse pues siempre habrá un desafío de campo no necesariamente patógenas, pero que estimulan permanentemente por tanto los títulos siempre serán con tenencia a incrementarse hacia el final del ciclo de producción.

Sin embargo no deja de ser importante tipificar, de que estamos enfrentando, clásica, variante, tipo vacuna????. y reorientar nuestro programa de vaciuunacion.

Saludos y éxitos

Carlos Vasquez.
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Xavier Rodriguez
down arrow
, , Estados Unidos de América
Dr. en Ciencias Veterinarias
Re: Experiencias practicas en el diagnostico de la infección de la Bolsa de Fabricio
18/04/2010 | Estimado Dr Valladares.

Lo felicito por su artículo esta muy bien presentado y ordenado, me ha aclarado ciertas inquietudes respecto a las diferentes manifestaciónes del VIBF como hacerle un diagnóstico temprano y establecer los controles preventivo mas adecuados en campo.
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