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Efectos de la bromhexina sobre la penetración de enrofloxacina en secreción bronquial de pollos

Publicado: 1 de septiembre de 2011
Por: Nora Mestorino, ML Marchetti, B Huber, Jorge O. Errecalde. Cátedra de Farmacología. Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad Nacional de La Plata, Buenos Aires, Argentina. INCAM S.A
Resumen

El objetivo del presente estudio fue determinar si la bromhexina, como agente fluidificante, tiene la capacidad de generar concentraciones superiores de enrofloxacina en secreciones bronquiales de pollos parrilleros tratados con una combinación enrofloxacina-bromhexina. Ciento veinte pollos fueron divididos en dos grupos de sesenta animales cada uno: un grupo fue tratado con enrofloxacina sola y el segundo fue tratado con ENR en combinación con BROM. Ambas formulaciones fueron administradas a razón de 10 mg/kg de ENR durante cinco días. Se obtuvieron muestras de plasma y de secreciones bronquiales a diferentes tiempos durante el tratamiento y hasta 24 horas post-administración. La presencia de ENR en todas las muestras se determinó mediante análisis microbiológico utilizando B. subtillis como cepa control. El análisis farmacocinético se realizó por método no compartimental mediante el programa WinNonlin Profesional 5.3 (Pharsight Inc., Mountain View, CA.). Los resultados del estudio mostraron que la bromhexina facilita la penetración del antimicrobiano a las vías respiratorias, logrando mayores concentraciones y de manera más rápida.
Palabras Clave: Enrofloxacina, Bromhexina, Secreción bronquial, Pollos, Farmacocinética.

Introducción
La bromhexina y su principal metabolito el ambroxol, (clorhidrato de trans-4-[(2-amino-3.5-dibromobenzil) amino] ciclohexanol), han sido ampliamente utilizados terapéuticamente en el tratamiento de enfermedades pulmonares debido a sus propiedades mucolíticas, además de estimular la liberación de sustancias surfactantes, normalizar la producción de moco y facilitar la expectoración. En estudios recientes se ha demostrado que poseen una acción antioxidante y antiinflamatoria que han sido atribuidas a su propiedad de inactivar radicales libres; asimismo se ha demostrado in vitro que estimulan la liberación de citoquinas (Gibbs et al., 1999), que favorecen la quimiotaxis de neutrófilos y también la absorción de sodio por parte del epitelio pulmonar.

La bromhexina puede ser administrada en combinación con agentes antimicrobianos en el tratamiento de infecciones respiratorias debido a su capacidad de disrupción de los mucopolisacáridos de la secreción bronquial mejorando la penetración bronquial de las drogas antimicrobianas. Escoula et al. (1981) encontraron que luego de la administración intramuscular de bromhexina se logró un aumento de la biodisponibilidad de espiramicina en las secreciones nasales de bovinos.
Este notable efecto estimuló a la administración de combinaciones entre bromhexina y antimicrobianos para el tratamiento de diversas enfermedades infecciosas del tracto respiratorio. Posteriormente Bergogne (1985) y Martin et al. (1993) corroboraron el mismo comportamiento al encontrar que el clorhidrato de bromhexina incrementó la concentración de oxitetraciclina dentro del mucus secretado.

La bromhexina se absorbe alcanzando una concentración máxima en plasma al cabo de una hora (Tmáx), con una semivida de absorción de 25 minutos. Experimenta un efecto de primer paso de un 75 a 80% y la biodisponibilidad absoluta es de 20 a 25%. La bromhexina se une a las proteínas plasmáticas (95 a 99%) y presenta un alto volumen de distribución. Su acumulación es a nivel pulmonar más que plasmático. La semivida de eliminación puede rondar entre 13 a 40 horas dependiendo de la especie.

El uso de bromhexina está aprobado por vía intramuscular u oral en terneros, cerdos y pollos a razón de 0.5 mg/kg/día durante 5 días consecutivos. Si bien el Comité para productos veterinarios de la EMEA no estableció un LMR para bromhexina (EMEA, 1998a) se recomienda un retiro de 24-48 h después de la última administración dado un ADI toxicológico de 0.3 mg/persona. No se recomienda su uso en gallinas productoras de huevos para consumo humano.

Enrofloxacina es un agente antimicrobiano desarrollado a fines de 1980 para ser utilizado exclusivamente en medicina veterinaria. Es una fluoroquinolona de segunda generación, con actividad bactericida frente a Enterobacteriaceae, otras bacterias Gram negativas y algunos cocos Gram positivos (Martínez et al., 2006; Otero et al., 2001a; 2001b). Las fluoroquinolonas dañan el DNA bacteriano y alteran el super-enrollamiento debido a la inhibición de la actividad de la girasa de DNA (Prescott, 2000). En algunas especies bacterianas, tales como E. coli, el principal sitio de acción es la DNAgirasa mientras que en otras, como S. aureus, lo es la Topoisomerasa IV. Considerando que estas enzimas tienen funciones algo distintas, es probable que las bacterias difieran en sus respuestas de acuerdo a cuál sea el punto de acción.

Está aprobado su uso terapéutico y profiláctico en pollos y otras especies domésticas. Los procesos infecciosos ocasionados por micoplasmas, colibacilos y pasteurellas, frecuentemente son tratados con enrofloxacina (Martínez et al., 2006).

Tras su aplicación oral, la enrofloxacina es bien absorbida y distribuida a nivel tisular para ser excretada por orina y por heces en altas concentraciones (Prescott, 2000). Se metaboliza en hígado dando origen a su principal metabolito, la ciprofloxacina (EMEA, 1998b). La ciprofloxacina también presenta actividad bactericida y es un compuesto aprobado para ser utilizado en medicina humana. En la mayoría de las especies animales el volumen de distribución de enrofloxacina es alto, siendo mucho mayor que el alcanzado por los betalactámicos y aminoglucósidos. Se concentra principalmente en saliva, secreción nasal; en mucosa, epitelio y secreción bronquial, así como en el hígado y en el tracto urinario. Penetra bien en el tejido pulmonar, fluido de revestimiento y macrófagos alveolares, resultando en concentraciones mayores a las séricas.

En base a lo presentado, nuestra hipótesis es que las concentraciones de enrofloxacina en lavado bronquial de pollos parrilleros tratados con una combinación enrofloxacina-bromhexina son superiores a las determinadas en parrilleros tratados con enrofloxacina solamente. Para esto se desarrolló un modelo de lavado de bronquios y sacos aéreos de aves, a efectos de determinar los niveles de antimicrobianos en secreciones.

Materiales & Métodos
Se utilizaron 120 pollos de 4 semanas de edad. Los animales fueron mantenidos y alimentados en forma convencional con acceso a agua y alimento balanceado "ad libitum". El alimento fue controlado durante todo el período que duró el ensayo, a los efectos de tener la certeza de ausencia de sustancias con poder antimicrobiano. Los animales experimentales fueron divididos en dos grupos:

Grupo 1
: Conformado por sesenta pollos parrilleros que fueron tratados durante cinco días con la formulación a base de enrofloxacina-bromhexina (Bromeflox®, Cevasa S.A.) a razón de 10 mg/kg y 0.5 mg/kg de peso vivo, respectivamente, por la vía oral conjuntamente con el agua de bebida.

Grupo 2
: Integrado por los otros sesenta pollos parrilleros, los que fueron tratados durante cinco días con la formulación a base de enrofloxacina sin bromhexina por el agua de bebida y a igual dosis que el grupo 1.
Los animales fueron sacrificados por anestesia con pentobarbital y sangrado. Al momento del sacrificio se procedió a la canalización de la tráquea, vaciado de sacos aéreos y realización de dos lavados bronquiales y de sacos aéreos con un volumen total de 40 mL de solución fisiológica a cada animal. Los animales fueron sacrificados en grupos de ocho integrantes a los siguientes tiempos: 24, 72, 120 h (durante el tratamiento) y 126, 132, 138 y 144 horas post-primera administración del medicamento, es decir 6, 12, 18 y 24 h post-última dosificación. Las muestras obtenidas fueron perfectamente rotuladas y almacenadas a -20º C hasta el ensayo microbiológico.

Las concentraciones equivalentes de enrofloxacina en las muestras extraídas fueron determinadas por método microbiológico (técnica cilindro placa) utilizando Bacillus subtilis BGA Merck (107 UFC/mL) como cepa control. Se colocó 100 µL/120mL de agar (8,3 x 103 UFC/mL). Se utilizaron placas de 25 x 25 cargadas con 120 mL de medio de cultivo inoculado en monocapa. Se colocaron 49 cilindros de acero inoxidable en cada placa, siguiendo un diseño previamente establecido. Los estándares (200 µL) se sembraron por duplicado y cada muestra problema (200 µL) fue sembrada por cuadruplicado. La metodología de cuantificación de enrofloxacina en los diferentes fluidos ensayados fue validada analizando los siguientes parámetros: linealidad, especificidad, precisión, exactitud y límite de cuantificación para cada matriz biológica.

Resultados & Discusión
El método microbiológico fue lineal entre 0.04 y 0.62 µg/mL equivalentes de enrofloxacina . El límite de cuantificación obtenido fue 0.08 µg/mL en plasma y el de detección fue 0.04 µg/mL. El porcentaje de recuperación fue de 84.62 ± 10.47 % con un CV de 12.37%.

En la Fig.1 se pueden observar las concentraciones promedio obtenidas en cada fluido tras la administración de ambas formulaciones.

La concentración plasmática máxima de ENR obtenida luego de la administración de la combinación ENR/Bromhexina fue mayor que la alcanzada tras la administración de ENR solamente (0.77 µg/mL vs 0.63 µg/mL, P = 0.0332), y se logró más tardíamente (Tmax 105.75 h vs 90 h). Si bien no se encontró diferencia estadísticamente significativa al comparar las áreas bajo la curva concentración plasmática en función del tiempo (AUC) entre ambos grupos, si se obtuvo diferencia significativa en el tiempo medio de residencia (MRT 88.14 vs 80.66 h, P= 0.0214). En lavado bronquial se encontraron mayores diferencias luego de la administración de la combinación Bromeflox, se obtuvo una mayor Cmax (0.90 vs 0.49 µg/mL, P= 0.0344) de manera más rápida (Tmax de 24 h vs 58.29 h, P= 0.0082), con una mayor biodisponibilidad (AUC 59.50 vs 36.03 µg*h/mL, P= 0.0457), pero el tiempo medio de residencia fue menor (MRT 55.10 vs 81.66 h, P= 0.0139). Los parámetros farmacocinéticos de relevancia obtenidos tras el análisis de las curvas de disposición plasmática y en lavado bronquial, conjuntamente con la comparación estadística entre ambas formulaciones se presentan en la Tabla I. Recordemos que las fluoroquinolonas pertenecen al grupo de antimicrobianos acción bactericida concentración dependiente, por lo cual el principal predictor de eficacia es el parámetro PK/PD Cmax/CIM > 8-10. La CIM90 reportada para la mayoría de los patógenos aviares es 0.06 µg/mL (Sanjib et al., 2005), de manera que en este estudio obtendríamos una relación Cmax/CIM90 de 15, es decir que la adición de bromhexina permitiría maximizar la eficacia de ENR.
Figura 1. Perfil plasmático y en lavado bronquial de enrofloxacina luego de la administración de la combinación bromhexina-enrofloxacina y tras la administración de enrofloxacina solamente en función del tiempo.
Efectos de la bromhexina sobre la penetración de enrofloxacina en secreción bronquial de pollos - Image 1
Tabla 1. Comparación estadística entre los parámetros farmacocinéticos plasmáticos y en lavado bronquial obtenidos tras la administración de ENR solamente vs Bromeflox® (Test de t)
 
 
Plasma
 
Lavado bronquial
 
 
 
ENR
ENR / BROM
 
ENR
ENR/BROM
 
Parámetro
Unidad
MEDIA
DS
MEDIA
DS
P
MEDIA
DS
MEDIA
DS
P
Tmax
h
90.00
35.71
105.75
28.13
0.3438
58.29
23.42
24.00
0.00
0.0082*
Cmax
µg/mL
0.63
0.14
0.77
0.13
0.0332*
0.49
0.29
0.90
0.36
0.0344*
AUC0-∞
µg.h/mL
61.83
15.35
69.82
26.31
0.2477
36.03
15.25
59.50
21.20
0.0457*
MRT
h
80.66
16.63
88.14
19.20
0.0214*
81.66
18.95
55.10
12.17
0.0139*

Conclusiones
De lo resultados obtenidos podemos concluir que Bromeflox es una formulación con ciertas ventajas frente a formulaciones a base de enrofloxacina solamente, ya que la bromhexina facilita la penetración del antimicrobiano a las vías respiratorias, logrando mayores concentraciones y de manera más rápida. La adición de bromhexina permite alcanzar una relación Cmax/CIM superior a 10 y así maximizar la eficacia de ENR.

Bibliografía
Bergogne B, Berthelot G, Kafe HP, Doournovo P. 1985. Influence of a fluidifying agent (bromhexine) on the penetration of antibiotics into respiratory secretions. Int. J. Clin. Pharmacol. Res. 5(3):341-344.
EMEA. 1998a. The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products, Veterinary Medicines Evaluation Unit. EMEA/MRL/503/98-FINAL URL:http://www.ema.europa.eu/docs/
en_GB/document_library/Maximum_Residue_Limits_-_Report/2009/11/WC500011112.pdf.
EMEA. 1998b. The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products, Veterinary Medicines Evaluation Unit. URL:http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/
Maximum_Residue_Limits_-_Report/2009/11/WC500014142.pdf.
Escoula L, Larrieu G, Camguilhem R. 1981. Enhancement of spiramycin concentration by bromhexin in the bovine nasal secretions. Annales de Recherches Veterinaires 12:317-320.
Gibbs BF, Scmutzler W, Vollrath IB, Brosthardt P, Braam U, Wolff HH, Zwadlo-Klarwasser G. 1999. Ambroxol inhibits the release of histamine, leukotrienes and cytokines from human leukocytes and mast cells. Inflamation Res. 48:86-93.
Martínez M, McDermott P, WalkerR. 2006. Pharmacology of the fluoroquinolones: a perspective for the use in domestic animals. The Vet. Journal 172(1):10-28.
Martin GP, Loveday BE, Mariot C. 1993. Bromhexine plus oxytetracycline: the effect of combined administration upon the rheological properties of mucus from the mini-pig. J. Pharm. Pharmacol. 45(2):126-130.
Otero JL, Mestorino N, Errecalde J. 2001a. Enrofloxacina: Una Fluoroquinolona de uso exclusivo en veterinaria. Parte I: Química, Mecanismo de acción, Actividad Antimicrobiana y Resistencia Bacteriana. Analecta Veterinaria 21(1):31-41.
Otero JL, Mestorino N, Errecalde J. 2001b. Enrofloxacina: Una Fluoroquinolona de uso exclusivo en veterinaria. Parte II: Farmacocinética y toxicidad. Analecta Veterinaria 21:42-49.
Prescott JF. 2000. In Antimicrobial Therapy in Veterinary Medicine, 3rd edn. Eds Prescott J, Baggot D, Walter R. Iowa State University Press, Ames, IA.
Sanjib I, Chandana, Pritam M Mohan B. 2005. Pharmacokinetics studies of enrofloxacin in Yak after intramuscular administration. Ir.J.Pharmacol.Therap. 4:91-94.
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Autores:
Jorge O. Errecalde
Universidad Nacional de La Plata - UNLP
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Nora Mestorino
Universidad Nacional de La Plata - UNLP
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César Jhamir Niza Morelli
28 de agosto de 2015
Excelente investigación.... Muchas gracias por el aporte y compartirlo. Saludos a todos los colegas...
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