Búsqueda de agentes infecciosos en psitácidos de la provincia de Buenos Aires

En la República Argentina no existen datos sobre las distintas enfermedades que se presentan en los psitácidos. La psitacosis, entidad de gran importancia en salud pública, es causada por Chlamydophila psittaci, bacteria GRAM negativa e intracelular obligada. Morfológicamente, presenta tres formas distintivas: el cuerpo elemental (CE), el cuerpo reticulado (CR) y el cuerpo intermedio (CI). Se describen 7 genotipos aviares de Cp. psittaci (A, B, C, D, E, F y E/B), de los cuales A, F y el recientemente incorporado E/B se encuentran asociados a la transmisión de la psitacosis de aves psitácidas a seres humanos. Las aves jóvenes presentan generalmente mayor susceptibilidad que los psitácidos adultos a la infección por Cp. psittaci. Los CEs se encuentran presentes en el polvillo producido por las descamaciones epiteliales y las plumas como así también en las heces secas, secreciones oculonasales y mucosas de la cavidad oral y faríngea de las aves infectadas. La ingestión de los CEs resulta en la infección de las células epiteliales intestinales. La infección por Cp psittaci puede cursar de manera asintomática en aves adultas o bien producir una enfermedad sistémica, aguda y frecuentemente mortal en individuos jóvenes. La demanda de diagnósticos rápidos hace que debamos responder al mercado de diagnóstico que solicitan tanto propietarios como agentes de la salud pública. Sin embargo, esta enfermedad es de difícil diagnóstico pues en la región no existen laboratorios que puedan realizar pruebas rápidas y precisas para detectar la infección en los loros (Andersen & Vanrompay, 2003; Harkinezhad et al., 2007; Saracelelebi & Ak, 2006).

Otras afecciones de suma importancia para los criadores y propietarios de mascotas, como la Enfermedad de Pacheco y la circovirosis, tampoco tienen un método desarrollado de diagnóstico en la región. La Enfermedad de Pacheco (EP) es producida por el herpesvirus psitácido 1 (HVPs -1). Es un virus de 80-100 nm de diámetro, ADN, envuelto del que se reconcen cinco serotipos (1 a 5) dentro de los cuales, el 1 es el que causa comúnmente la enfermedad de Pacheco. La EP se caracteriza por presentar un curso hiperagudo o agudo. Los psitácidos afectados muestran signos clínicos inespecíficos tales como somnolencia, letargia, anorexia, diarrea intermitente, poliuria y polidipsia. La presencia de heces verdosas líquidas y uratosas hacen pensar en la severidad de las lesiones sufridas por el hígado. Ocasionalmente, los individuos afectados pueden mostrar conjuntivitis, sinusitis, diarrea hemorrágica y tremores de cabeza, cuello, alas y patas. Cabe destacar que la mayoría de los psitácidos presentan buena condición corporal al momento del deceso (Gerlach, 1999; Phalen et al., 2006; Tomaszewski et al., 2001). La enfermedad del pico y la pluma es causada por un Circovirus perteneciente a familia Circoviridae. Es un virus ADN de 14 a 17 nm de diámetro y carente de envoltura lipídica. La enfermedad se presenta principalmente en individuos juveniles o en adultos jóvenes, sin embargo fueron descriptos casos de psitácidos de más de veinte años de edad que manifestaron signología clínica. En base a las marcadas diferencias presentes en las manifestaciones clínicas, la enfermedad se la puede agrupar de acuerdo a su curso en hiperaguda, aguda y crónica. El curso hiperagudo de la enfermedad está presente en neonatos que muestran signos de septicemia acompañada de neumonía, enteritis, pérdida rápida de peso y muerte. Por su parte, el curso agudo afecta preferentemente a aves jóvenes durante su primera muda de plumas. Luego de varios días de decaimiento, pueden notarse cambios repentinos en el plumaje en desarrollo, como fracturas, deformidades, sangrado y caída prematura en las plumas afectadas. Finalmente, el curso crónico de la enfermedad del pico y de la pluma se caracteriza por la progresiva aparición de plumas anormales en desarrollo durante sucesivas mudas (de Kloet & de Kloet, 2004; Gerlach, 1999; Ritchie et al., 2003).

El SENASA ha mostrado sumo interés en conocer la real situación de las enfermedades en país, a fin de poder controlar las importaciones y exportaciones de estos animales. Es por ello que este trabajo tuvo como objetivo la determinación de la presencia de Chlamydophila psittaci, herpesvirus y circovirus en psitácidos remitidos al Laboratorio de Diagnóstico de Enfermedades de las Aves y los Pilíferos (LaDEAP) a través de la técnica de PCR en tiempo real.

Se utilizó un equipo de Real-Time PCR Bio Rad ^TM ¡CYCLER Q 5^® y IQ^TM SYBR GREEN SUPERMIX^® como fluoróforo. Para la determinación de Chlamydophila psittaci mediante una técnica de PCR en tiempo real se tomaron muestras de materia fecal y órganos (hígado) provenientes de 12 ejemplares de Amazona estiva, 2 Psephotus varius, 1 Amazona tucumana, 1 Aratinga jandaya, 3 Psittacula krameri, 2 Platycercus elegans, 1 Alisterus scapularis, 1 loro adulto (especie sin determinar) y un pool de 5 loros (especie sin determinar). El procedimiento de la prueba de PCR en tiempo real se desarrolló como sigue: Primer forward 5´-CACTATGTGGGAAGGTGCTTCA- 3´, Primer reverse 5´ CTGCGCGGATGCTAATGG- 3´. La condiciones de ciclado aplicadas estuvieron dadas por el siguiente protocolo: el ciclo 1, repetido 1 vez, a 95°C durante 2 min; el ciclo 2, que fue repetido 45 veces, estuvo compuesto por el paso 1 a 95°C durante 5 seg, el paso 2 a 62°C durante 15 seg y el paso 3 a 72°C durante 30 seg. Finalmente, el ciclo 3 aplicado consistió en una repetición a 72°C durante 2 min (Geens et al., 2005; Harkinezhad et al., 2007; Pantchev et al., 2009).

Para la determinación de la Enfermedad de Pacheco se estudiaron las muestras de tejido de: 2 Rosella, 1 Psittacula krameri, 5 Platycercus eximius, 7 Amazona aestiva, 1 Psittacus erithacus 1 Psephotus, 1 loro (especie sin determinar), 1 cotorra australiana y 1 Alisterus scapularis. En cuanto al desarrollo de la técnica de PCR en tiempo real, se  utilizaron los siguientes primers: Primer forward GAGCGACTTCTCAACGACGTC, Primer reverse GGGCTTGGTTAGGTACAGGT, y el siguiente ciclo: Ciclo 1 (1x) 95°C 10 seg, Ciclo 2 (40x) 95°C 5 seg, 69°C 30 seg, Ciclo 3 (1x) 69°C 30 seg. (Katoh et al., 2008; Mackay et al., 2002).

Considerando la enfermedad del pico y de la pluma, se describió el ensayo universal de PCR utilizado por Hsu et al. (2006), en los que fueron analizadas muestras de excreciones provenientes de 6 Amazona aestiva. Para esta enfermedad se dicidió la utilización de los siguientes primers: Primer forward CCGAGAAGTATTGCAGTAAAGAGGG y Primer reverse TCTGGGAACTCTCGCGCGA, con el siguiente protocolo: Ciclo 1 (1X) 95°C 5 min, Ciclo 2 (40x) 94°C 30 seg, 60°C 30 seg, 72°C 30 seg, y Ciclo 3 (1X) 72°C 5 min (Bassami et al., 2001; Hsu et al., 2006; Mackay et al., 2002).

Los resultados de la búsqueda de la presencia de Chlamydophila psittaci en los animales muestreados arrojaron una cantidad de 2 animales positivos de un total de 24. Con respecto a la determinación de herpevirus los resultados obtenidos fueron 1 animal positivo de 20 psitácidos muestreados. Por último, el análisis de circovirus de las muestras remitidas al laboratorio resultó en 1 animal positivo de 6 estudiados. Este grupo de trabajo halló correspondencia en la efectividad de las pruebas realizadas con el trabajo de Katoh et al. (2008) en cuanto a la especificidad y sensibilidad que demuestra la utilización de un equipo de PCR en tiempo real usando SYBR green. Con respecto al agente etiológico de la enfermedad del pico y de la pluma, hemos podido diagnosticar por primera vez la presencia de circovirus en el país.

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