La microbiología y la biología molecular como herramientas de diagnóstico de la calidad de suelos agrícolas

La adopción de la siembra directa como manejo conservacionista del suelo, impulsado por la incorporación de biotecnología ha cambiado radicalmente la historia de uso del suelo en la región. Inicialmente el foco de observación sobre el cambio en las propiedades del suelo a partir del cambio en las técnicas de su manejo fue orientado a las propiedades físicas y químicas del suelo y se encontraron así nuevos valores fisicoquímicos que caracterizan y diferencian a la Siembra Directa en comparación con la Labranza Convencional. Varios años de estudio dejan en claro las ventajas de las prácticas de la Siembra Directa a nivel internacional, sobre todo en lo que respecta al manejo del agua (Derpsch et al 2010). La producción continua de cultivos para la industria alimentaria o para la generación de biocombustibles implica la continua remoción de nutrientes del suelo. Lograr procesos sustentables que compatibilicen una máxima productividad con un mínimo impacto ambiental es el mayor desafío para la agricultura de estos tiempos. En estos procesos, los ciclos de los elementos y la biología del suelo juegan un rol central en el funcionamiento del suelo. Hacia fines del siglo pasado, cuando se discutía acerca de cuáles serían los temas que trataría la ciencia en el siglo XXI, el Suelo fue presentado como una de las nuevas fronteras del conocimiento. El suelo, eso que tenemos tan cerca, tan a mano, que trabajamos cotidianamente desde que el hombre desarrolló la agricultura, se presenta como algo desconocido o con mucho aún por conocer ¿y dónde está el origen de ese desconocimiento? O mejor dicho ¿en qué momento la ciencia se dio cuenta de que el suelo es una verdadera caja negra donde está casi todo por descubrir? Un hito del reconocimiento de este desconocimiento se encuentra en la paradoja de laboratorio llamada “la gran anomalía del recuento en placa” que consiste en reconocer que el número de microorganismos que estimamos a partir de su cultivo en medios de crecimiento en el laboratorio, no coinciden en absoluto con el número de microorganismos que se cuentan en forma directa por técnicas microscópicas de tinción vital (Staley and Kanopa, 1985). Esta anomalía nos enfrenta con la dimensión de nuestro desconocimiento: solo el 1% de los microorganismos que viven en el suelo ha sido cultivado y conocida su fisiología a partir del análisis de sus cultivos en el laboratorio. El desarrollo de nuevas técnicas bioquímicas y de biología molecular nos permiten hoy mirar mejor y en forma mas integral esta caja aún negra de la (micro)biología del suelo. Es muy importante remarcar que la ciencia de la microbiología que hemos desarrollado desde Pasteur a la fecha, a partir de esa limitada fracción de lo que vive en el suelo, nos ha permitido reconocer la enorme importancia de los microorganismos en los ciclos biogeoquimicos de los elementos.

Además, la posibilidad de crecerlos y multiplicarlos en el laboratorio nos permite diseñar insumos biológicos para el agro de suma importancia como herramientas modernas de manejo sustentable de la agricultura. Tal es el caso de los microorganismos que se utilizan como biofertilizantes y aquellos que se utilizan como herramientas de biocontrol de enfermedades y plagas de cultivos.

Podemos clasificar la biología del suelo de acuerdo al tamaño de los organismos vivos. Así podemos describir la macrofauna (0,7 - 20 mm), la mesofauna (0,1 – 5 mm) y la microbiota (0,1 – 100 ?m). En esta última reconocemos la presencia de organismos pertenecientes a los tres grandes dominios de la biología: las archeas, las bacterias y los eucariotes (hongos y protozoos). Por las limitaciones técnicas para ver a los microorganismos en su verdadera diversidad morfológica, la microbiología del suelo es el verdadero límite de nuestro (des)conocimiento y allí residen, seguramente, muchas respuestas a fenómenos que tienen que ver con la fertilidad, aptitud, supresividad de enfermedades y resiliencia de los suelos, entre otros, y que aún no sabemos explicar completamente.

Como bien dijo el Zorro en El Principito: lo esencial es invisible a los ojos. Si no se puede ver a los microorganismos, al menos, se pueden intentar ver las huellas que dejan aquellos actores invisibles. Las técnicas de la biología molecular y la bioquímica son los nuevos anteojos que nos permiten ver aquello que antes no existía pues simplemente no lo veíamos. La bioquímica y la biología molecular nos permiten estudiar el funcionamiento de los microorganismos que habitan en el suelo, in situ, sin necesidad de cultivarlos para tener una masa suficiente como para hacer ensayos y análisis con ellos (de Brujin 2011). Esta manera de encarar el estudio de la biología del suelo se enmarca en los modelos de la Biología Sistémica, que enfrenta los problemas y sistemas complejos como un todo, sin necesidad de estudiar cada una de sus partes para luego integrarlas. Con este marco teórico podemos enfrentarnos al suelo como un organismo vivo resultante de todas las propiedades intrínsecas determinadas por los componentes vivos que en él habitan y de las propiedades emergentes que surgen de la interacción de los mismos y complejidad del sistema en diferentes niveles. De esta manera analizamos su base genética y si funcionamiento en forma integral, haciendo análisis metagenómicos y haciendo estudios de fisiología de los suelos, estudiando su perfil bioquímico analizando diferentes grupos de biomoléculas y estudiando su respiración y actividades metabólicas.

Este nuevo tipo de lectura del suelo no se contrapone con el análisis y estudio por separado de los diferentes niveles de organismos vivos que en él habitan, ni aún con el estudio de algún tipo de microorganismo en particular, por ejemplo, para mencionar aquellos nombres que pueden resultarnos familiares, los Rizobios, las Micorrizas, los hongos patógenos, las Pseudomonas, etc.

 

El reconocimiento de los beneficios de la adopción de la Siembra Directa asociada a la rotación de cultivos y el uso de cultivo de cobertura, al manejo integral de plagas y al manejo responsable de agroquímicos, ha permitido desarrollar el concepto de Buenas Prácticas Agrícolas sobre cuyas definiciones adaptadas a las características ambientales de cada región permiten impulsar la Agricultura Certificada como una iniciativa tendiente a la certificación de los procesos en base a sus sustentabilidad. Aapresid ha lanzado la Agricultura Certificada sobre la base de indicadores de suelo de tipo físicos y químicos dado que no existe aún en la comunidad científica un consenso global respecto de indicadores de calidad de suelo de base biológica. Las razones de esta carencia de conocimiento radican en la complejidad biológica de los suelos y las limitaciones de nuestro conocimiento en esas áreas como consecuencia de las limitaciones técnicas para abordar el problema.

Entre los años 2008 y 2013 se desarrolló el proyecto multidisciplinarios BIOSPAS (Biología del Suelo y Producción Agropecuaria Sustentable, www.biospas.org) en el que se combinó la acción pública con la privada en la participación concurrente de 12 grupos de investigación provenientes de 11 Instituciones académicas, y tres entidades del ámbito productivo privado: Aapresid, Rizobacter Argentina S.A. y La Lucía S. A. del Grupo Romagnoli; quienes cofinancian el proyecto junto con el FONCyT del Ministerio de Ciencia Tecnología e Innovación Productiva y las Instituciones Beneficiarias del Proyecto, varias universidades nacionales como UNQ, UNLP, UNC, UCC, UNRC, UNNE, UBA, el CONICET y el INTA (Wall 2011).

En el marco del proyecto decidimos estudiar en forma comparativa suelos manejados con Buenas Prácticas Agrícolas y suelos con manejos no-sustentables que se alejan de éstas y que tienden al monocultivo de soja, utilizando ambientes naturales cercanos a los sitios de estudio como suelos de referencia. Los tres tratamientos se replicaron a lo largo de 400 km en cuatro sitios/ambientes diversos localizados en las regiones de Bengolea (Córdoba), Monte Buey (Córdoba), Pergamino (Buenos Aires) y Viale (Entre Ríos).

Así se analizaron en estas muestras: la dinámica de la materia orgánica y variables fisicoquímicas, la física y la micromorfología estructural de los suelos, la bioquímica de los mismos analizando actividades enzimáticas, perfiles de ácidos grasos de lípidos del suelo, fracciones de glomalina, actividad respiratoria de los suelos; actividad nitrificante, la diversidad de micorrizas desde un punto de vista morfológico y desde un punto de vista molecular; la actividad de degradación de rastrojos y actividad celulolítica; los grupos de bacterias Pseudomonas y Burkholderia por técnicas cultivables y por técnicas independientes de cultivo, la diversidad bacteriana en general analizada por técnicas independiente de cultivo a partir del análisis del DNA ambiental extraído de la muestra de suelo, los grupos de bacterias fijadoras de nitrógeno por técnicas independientes de cultivo; la meso y macro fauna asociada a estos suelos; la expresión de enfermedades y la capacidad supresiva de estos suelos.

Se trabajó con muestras compuestas obtenidas a partir de la combinación de al menos 20-25 piques independientes, y por triplicado o quintuplicado según el análisis, para cada tratamiento y sitio de muestreo, conservando las muestras a 4ºC desde su toma hasta el laboratorio. Fracciones equivalentes de cada muestra se repartieron a cada laboratorio desde el momento de la toma en el campo.

 

Del análisis de los resultados en el seno de cada grupo y ajustados a la lógica de cada tema / concepto investigado, surgen una serie importante de variables que permiten discriminar entre suelos con Buenas Prácticas Agrícolas o prácticas no sustentables, incluso en forma independiente a veces de la importante diferencia de textura entre los suelos de los diferentes lugares de muestreo.

Entre las diferentes variables que aparecen cuantitativamente capaces de discriminar entre diferentes manejos del suelo podemos mencionar: C orgánico particulado / C orgánico total; estabilidad de agregados; hidrofobicidad de agregados; hidratos de carbono solubles; niveles de fauna total y del grupo Lumbricina; niveles de mesofauna total y de algunos grupos en particular como Oribatida y Prostigmata; niveles de agregados biogénicos, niveles de recuentos de colonias de Pseudomonas totales / colonias de bacterias heterótrofas totales; niveles de recuento de colonias de Pseudomonas fluorescentes / Pseudomonas totales; niveles de algunos grupos de bacterias no cultivables asociados a acidobacterias y bacterias asociadas al género Rubillimicrobium; potencial de desnitrifcación; niveles de fracción de proteínas relativas a la glomalina fácilmente extraíble; densidad de esporas micorrícicas; humedad y respiración basal; perfil de ácidos grasos de lípidos neutros; respiración inducida por diversos sustratos y su dependencia con la disponibilidad de N; niveles de supresividad de los suelos.

La conclusión más interesante que surge de este listado de datos es que la hipótesis de partida ha sido ampliamente y categóricamente corroborada, es decir que las buenas prácticas agrícolas pueden caracterizarse por variables de origen biológico.

Debemos aún avanzar en el análisis multivarial de estos datos buscando encontrar qué relación existe entre los mismos que nos permita construir un modelo de funcionamiento de la biología de suelo para explicar biológica y bioquímicamente las Buenas Prácticas Agrícolas utilizadas en los suelos y su deriva hacia lo que ocurre en suelos bajo manejos con prácticas agrícolas no sustentables.

Se extrajeron los lípidos totales de las muestras de suelo analizadas, que luego fraccionamos en lípidos neutros (asociados a sustancias de reserva, como los aceites de semillas y las grasas de los animales) y fosfolípidos (asociados a la constitución de las membranas de todos los organismos vivos). A partir de estas diferentes fracciones de lípidos, totales, neutros y fosfolípidos, analizamos la diversidad de ácidos grasos existentes en dichas fracciones. En cada tipo de suelo sitio/tratamiento se encontraron alrededor de 70 ácidos grasos diferentes en su naturaleza y diferentes en sus cantidades, que pueden ser analizados en forma individual o pueden ser agrupados en base a sus características químicas, por ejemplo “ácidos grasos saturados”. “ácidos grasos mono-insaturados”, “ácidos grasos poli-insaturados”, “ácidos grasos metilados”, “ácidos grasos hidroxilados”, etc. Un análisis discriminante de las 60 muestras de suelo de un muestreo (3 tratamientos –buenas prácticas, prácticas no-sustentables y ambiente natural de referencia- x cuatros sitios – Bengolea, Monte Buey, Pergmamino, Viale- x quintuplicado de las muestras) en su diversidad de ácidos grasos permite agrupar las muestras muy claramente de acuerdo al tratamiento o manejo del suelo. Este resultado sugiere que independientemente de la textura de los suelos y las condiciones macroambientales de cada sitio, el perfil de lípidos de los suelos viene determinado por su manejo agrícola, es decir por la función biológica que se logra de esos suelos, muy probablemente conducida por la diferencia en el nivel de rotación de cultivos. Además de este resultado de alguna manera cualitativo, encontramos que entre los diferentes ácidos grasos existen algunos casos que presentan niveles significativamente diferentes entre buenas prácticas (rotación) y prácticas no sustentables (monocultivo), por ejemplo el ácido graso denominado 20:0 (un ejemplo de ácido graso saturado) aparece como marcador de las buenas prácticas agrícolas mientras que el ácido graso denominado 18:1w7c (un ejemplo de ácido graso mono-insaturado) aparece sistemáticamente elevado en las prácticas no-sustentables, como potencial marcador bioquímico de este tipo de manejo.

En un análisis metagenómico por pirosecuenciacion de la región hipervariable V3-V4 del 16S bacteriano amplificado a partir de ADN ambiental extraído de las muestras de suelo, obtuvimos unos 210.000 secuencias de ADN sin errores y útiles para el estudio de la diversidad de bacterias en el suelo. Al analizar cómo se organiza y estructura toda esta información, encontramos que sobre la base de todas las secuencias obtenidas en cada una de las muestras (sitio/tratamiento), las mismas organizan y agrupan en forma geográfica. Es decir, las diferentes muestras se parecen más entre sí en la diversidad de sus secuencia de ADN, por localidad geográfica, que la semejanza que existe entre muestras de igual tratamiento en los diferentes sitios de muestreo. Es decir, se agrupan globalmente por sitio, en forma diferente a como se agrupaba la diversidad de los lípidos del suelo, por tratamiento. Sin embargo buscando entre toda la información obtenida cuales grupos de secuencias o unidades taxonómicas operativas eran característicos de los diferentes tratamientos. En particular buscamos si existían grupos que sistemáticamente y en forma estadísticamente significativa, diferenciaban las buenas prácticas de las prácticas no sustentables. Pudimos encontrar esos grupos. Algunos grupos taxonómicos aumentan diferencialmente en las buenas prácticas, otros aumentan diferencialmente en la prácticas no sustentables (Figuerola et al 2012). Entre estos grupos, se encontró que el grupo GP1 de Acidobacterias caracterizaría a las buenas prácticas mientras que un grupo de bacterias del género Rubellimicrobium caracterizaría a las prácticas no sustentables, independientemente del sitio y de la textura del suelo. Estos resultados fueron luego validados por técnica de PCR cuantitativa (otra poderosa técnica molecular) cuyos resultados mostraron que estos grupos bacterianos caracterizan y diferencian a las buenas prácticas agrícolas de las no-sustentables, en sucesivos muestreos de suelo a lo largo de dos años y en diferentes estaciones del año y bajo diferentes cultivos.

En un segundo análisis metagenómico utilizando la región V4 del 16 S de muestras de tres momentos diferentes (verano 2010, invierno 2010, verano 2011) encontramos que la diversidad bacteriana a nivel regional es mantenida por la Buenas Prácticas Agrícolas a un nivel equivalente a lo que sucede entre ambientes naturales mientras que el monocultivo disminuye la diversidad bacteriana a nivel regional en forma significativamente diferente a los manejos anteriores (Figuerola, Guerrero, Turkowsky, Wall y Erijman, 2014, aún no
publicado). Este hallazgo plantea la enorme importancia de la rotación de cultivos para preservar la diversidad biológica de los suelos que garantiza su funcionalidad plena.

 

Si bien todos estos datos descritos más arriba deben ser validados en nuevos campos y con una mayor cantidad de muestreos, los mismos sugieren que quizás en los próximos años, este tipo de análisis resulte cada vez más común entre los análisis que se realicen a los suelos. Es de esperar que, sobre la base de estos nuevos tipos de análisis, podamos modificar nuestra práctica de manejo del suelo hacia prácticas más sustentables.

En definitiva, otra importante conclusión de estos estudios es que los mismos nos han permitido visualizar cuánto tenemos aún por descubrir y conocer en nuestros suelos y cuánto conocimiento y tecnología podemos aún incorporar en los manejos inteligentes de nuestros suelos para lograr producciones agroalimentarias o de biocombustibles cada vez más sustentables.

 

Al FONCyT, Aapresid, Rizobacter Argentina SA y La Lucía SA del Grupo Romagnoli por la financiación del proyecto BIOSPAS (PAE 36976 del MINCyT), a todos los integrantes del proyecto BIOSPAS y en particular al Dr. Alejandro Ferrari quien ha desarrollado el trabajo sobre los lípidos del suelo y al Dr. Leonardo Erijman, la Dra. Eva Figuerola y el Lic. Leandro Guerrero quienes han desarrollado principalmente el trabajo sobre diversidad bacteriana a partir del análisis del ADN del suelo.

 

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Derpsch R, Friedrich T, Kassam A, Li H (2010) Current status of adoption of no-till farming in the world and some of its main benefits. Intl J Agric Biol Eng 3: 1-25.
Figuerola, E.L.M., Guerrero, L.D., Rosa, S.M., Simonetti, L., Duval, M.a.E., Galantini, J.A. et al. (2012) Bacterial Indicator of Agricultural Management for Soil under No-Till Crop Production. PloS One 7: e51075.
Goddard T, M Zoebisch , Y Gang, W Ellis, A Watson and S Sombatpanit (Eds.) 2008. No Till Farming Systems. WASWC Special Publication No.3, 540pp.
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