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Diversidad Microbiana en suelos de Argentina

Relevamiento de la Diversidad Microbiana en suelos agrícolas de la Región Pampeana

Publicado: 10 de julio de 2012
Por: Oksana Sydorenko; Tosi, M.; Martinez, A.; Orlowski, J.F.; Olga Correa; Montecchia, M.S.; Soria, M.A. (Cátedra de Microbiología Agrícola e Instituto de Investigaciones en Biociencias Agrícolas y Ambientales (INBA-CONICET), Facultad de Agronomía, Universidad de Buenos Aires); Miriam Raquel Barraco (EEA INTA General Villegas); y Martín Díaz Zorita(INBA-CONICET y Novozymes BioAg S.A.)
Resumen

RESUMEN

Actualmente existe una batería de modernas metodologías microbiológicas que permiten evidenciar cambios sutiles en la estructura y composición de los suelos. La aplicación de estas metodologías no está muy difundida porque en ocasiones sus sensibilidades son tan altas que dificulta el análisis de los resultados. El objetivo de este trabajo es estudiar la diversidad microbiana en suelos sometidos a distintos manejos agronómicos en un experimento de larga duración en la EAA Gral. Villegas del INTA (oeste de la Pcia. de Buenos Aires). Se empleó un enfoque integral de metodologías independientes y complementarias: DGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis) y CLPP (Community level physiological profiles). DGGE permite caracterizar la estructura genética de la comunidad. CLPP estima la diversidad fisiológica de las comunidades. Detectamos diferencias en la estructura genética de las comunidades en función de la fertilización, y, en lotes fertilizados, en función de las labranzas. Observamos una mayor homogeneidad en suelos con labranza convencional y mayor diversidad con siembra directa. Los perfiles fisiológicos mostraron una tendencia de comportamiento diferente de la biota en lotes con y sin fertilización, así como un mejor agrupamiento para labranza convencional en lotes fertilizados. De las estrategias de manejo, la fertilización parece ser el factor primario para el comportamiento de las comunidades, mientras que el tipo de labranza tiene efectos secundarios.

PALABRAS CLAVE: DGGE; CLPP; Manejo agronómico

INTRODUCCIÓN
La biodiversidad microbiológica es un atributo del suelo que lleva implícito el concepto de su capacidad de prestar servicios, ya que son los microorganismos los que desempeñan el papel clave en el funcionamiento y la fertilidad del mismo. Estos regulan los principales procesos del suelo, como la descomposición de la materia orgánica, el ciclado de nutrientes, y la retención del agua. La alta sensibilidad de las comunidades microbianas y su consecuente rápida respuesta a los cambios en el suelo, hacen que el monitoreo de su variación sea una herramienta muy valiosa para proveer señales tempranas de alteración del ambiente edáfico (Anderson, 2003; Bastida et al., 2008, Ritz et al., 2009). Una de las herramientas disponibles para evaluar el aspecto biológico del suelo es la diversidad, la cual constituye una de las principales propiedades de la ecología de comunidades microbianas es la diversidad, ofreciendo información integrada sobre el estado del suelo. Dentro de la diversidad es importante estudiar tanto la estructura genética como la función de las complejas comunidades microbianas.
Actualmente existe una batería de modernas metodologías microbiológicas que permiten evidenciar cambios sutiles en la estructura y composición de los suelos. Éstas permiten realizar evaluaciones con mínimas perturbaciones de la muestra de suelo. Por otra parte, permiten incorporar a los análisis el aporte de los microorganismos no cultivables. Dos métodos se destacan especialmente por responder bien a los objetivos propuestos: las técnicas DGGE o Denaturing gradient gel electrophoresis (Muyzer et al., 1993) y CLPP o Community level physiological profiling (Garland et al., 2010). El primero es un método de fingerprinting basado en el análisis de secuencia de los genes ribosomales que permite realizar el análisis de la estructura genética de las comunidades. La técnica CLPP proporciona una caracterización de las comunidades microbianas desde el punto de vista catabólico a través de la utilización diferencial de un panel de sustratos carbonados.
Las metodologías descriptas fueron aplicadas por investigadores de nuestro grupo de trabajo para el análisis de las comunidades microbianas de la ecorregión de Las Yungas (Montecchia et al., 2007, 2008, 2009, 2011). Los resultados exitosos de estas investigaciones hacen suponer que dichas metodologías también resultarán adecuadas para el estudio del impacto de las prácticas agrícolas en zonas productivas de La Región Pampeana.
El objetivo de este trabajo es realizar relevamiento de la diversidad de las comunidades microbianas, aplicando una estrategia integrada por diferentes enfoques, en suelos sometidos a distintos manejos agronómicos en un experimento de larga duración.
 
MATERIALES Y MÉTODOS
Se analizaron comunidades microbianas presentes en lotes experimentales de la EAA Gral. Villegas del INTA (Drabble, oeste de la Pcia. de Buenos Aires) en un experimento de larga duración, iniciado en 1991. En él se evalúan en una rotación continua maíz-soja, diferentes tratamientos de labranza: convencional, con reja y vertedera (LC); vertical, con cincel (LV) y labranza cero o siembra directa (SD). A su vez se aplican 2 niveles de fertilización: 75 kg/ha de MAP + 200 kg/ha de urea (en V6) en maíz y 50 kg/ha de MAP en soja. El diseño del ensayo es completamente aleatorizado con 6 bloques. En un año dado 3 bloques se encuentran con cultivo de soja y 3 con maíz, cambiando en el año siguiente.
Es muestreo se realizó en el mes de agosto del año 2011. Se tomaron muestras en 2 sitios para cada tratamiento. De cada sitio se extrajeron 3 submuestras con un barreno hasta 5 cm de profundidad, zona de mayor número y actividad de microorganismos. Las submuestras se almacenaron y se procesaron por separado. En el laboratorio éstas fueron tamizadas a través de una malla de 2 mm y almacenadas a -80 y 4ºC según se destinen a análisis moleculares o a estudios fisiológicos, respectivamente.
Para el análisis de la diversidad genética de las comunidades se empleó la metodología DGGE. Los análisis se limitaron a los bloques con soja. La extracción de ADN de las muestras se realizó con el kit comercial PowerSoil DNA de MO BIO. La metodología fue la descripta por Zwart y Bok (2004), con modificaciones (Correa et al., 2007). Se amplificó por PCR el gen que codifica para el RNAr 16S con primers universales para bacterias F984GC y R1378 (Heuer et al., 1997). Los productos se separaron por electroforesis en geles de poliacrilamida 6% con gradiente desnaturalizante 45-65% a 60°C (Correa et al., 2007) empleando el equipo DGGEK-2001-220 (CBS Scientific). Los geles se revelaron con SYBR Green I (Molecular probes). Las imágenes se obtuvieron con el sistema de documentación Kodak EDAS120. El análisis de los perfiles genéticos y la construcción de dendrogramas se efectuó con el programa GelCompar II (Applied Maths, Kortrij, Bélgica) utilizando el coeficiente Pearson y el método de agrupamiento jerárquico UPGMA.
La caracterización funcional o catabólica de las comunidades microbianas se efectuó con la metodología CLPP utilizando microplacas de 96 wells preparadas con 12 sustratos carbonados (Ruiz et al., 2008). La extracción se realizó suspendiendo 2 gr de suelo en 10 ml de agua estéril e incubando en agitación a 26 ºC durante 24 horas. Luego se sembraron diluciones de 1.10-10 en los wells. Éstas fueron incubadas a 28°C durante 7 días y se realizarán lecturas de absorbancia a 590 nm cada 24 h (Correa et al., 2007). Sobre los resultados se efectuó análisis multivariado de componentes principales.
Para analizar el contenido de humedad en las muestras se secaron en estufa 20 gr de suelo hasta peso constante. La humedad gravimétrica se obtuvo por diferencia de peso húmedo y seco del suelo. El contenido de fósforo fue medido en el año 2006, utilizando el método de Bray I y nos fue proporcionado por los investigadores de la EAA Gral. Villegas del INTA. Los datos se analizaron mediante ANOVA con el software estadístico "R" (R foundation for Statistical Computing) versión 2.5.1 (2007).
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El contenido de fósforo por el método de Bray I en los primeros 5 cm del perfil mostró diferencias significativas (p<0.01) a favor de los lotes con fertilización, sin ser significativo el efecto del tipo de labranza. Comportamiento contrario se observó para el contenido de humedad gravimétrica, donde no hubo efecto significativo de la fertilización y sí de la modalidad de labranza (p<0.01). El suelo manejado por SD tuvo contenidos de humedad significativamente superiores que los de LC y LV. Entre estas últimas no se detectaron diferencias significativas.
El análisis de clusters (Figura 1a) definió 2 grandes grupos diferenciando entre tratamientos con (I) y sin (II) fertilización fosforada, excepto para uno de los sitios de SD sin fertilizar. Los perfiles genéticos de los suelos con LC y LV son más homogéneos y similares entre sí. La fertilización fosforada, en este caso, parece ser el factor dterminante para el perfil genético de las comunidades. La variabilidad dentro de cada tratamiento se ve sujeta a la intensidad de disturbio que en él se aplique. La aplicación de fósforo parece incrementar la variabilidad tanto entre tratamientos como entre sitios, ya que, en general, los tratamientos que no reciben fósforo, independientemente del tipo de labranza presentan perfiles más homogéneos.
Si analizamos las submuestras de cada sitio de los suelos con SD y LC (Figura 1b) en lotes con fertilización, se evidencia una diferenciación entre perfiles en función de la modalidad de labranza. El suelo con LC parece ser más homogéneo que el manejado con SD, ya que muestra una mayor similitud tanto entre sitios, como entre las submuestras de cada sitio.
Figura 1: Dendrograma UPGMA generada a partir de perfiles genéticos de las comunidades microbianas: a) de manejos de siembra directa (SD), labranza convencional (LC) y labranza vertical (LV) con (+P) o sin ( ) fertilización fosforada; b) de diferentes submuestras de los sitios 1 y 2 para lotes con siembra directa (SD) y labranza convencional (LC) con fertilización fosforada.
Relevamiento de la Diversidad Microbiana en suelos agrícolas de la Región Pampeana - Image 1
Para el caso de perfiles funcionales (Figura 2) no se observan agrupamientos definidos, sin embargo en los lotes con fertilización fosforada las muestras de LC tiendes a separarse del resto. Los primeros 2 componentes principales explican un 54%.
Figura 2: Análisis de componentes principales de perfiles microbianos para suelos con SD (?), LC () y LV (x): a) lotes sin fertilización; b) lotes fertilizados.
Relevamiento de la Diversidad Microbiana en suelos agrícolas de la Región Pampeana - Image 2
Con ambas metodologías de análisis observamos una mayor dispersión para los datos de siembra directa. Esto en parte puede atribuirse a una gran cantidad de micrositios que se originan en estos lotes, debido a un menor disturbio y la ausencia de mezclado del suelo. Con el incremento de la cantidad de micrositios de diferentes características, la tendencia será hacia una mayor diversidad de la biota que habita el suelo. Por otro lado, cierta parte de la variabilidad observada en los análisis de CLPP para todos los tratamientos, probablemente, se deba a la diferencia en los cultivos antecesores entre los lotes. Éste puede tener una influencia considerable sobre las comunidades microbianas y en mayor medida en suelos con siembra directa (Lupwayi et al., 1998; Zak et al., 2003).
Es notoria la relevancia de la fertilización sobre las comunidades analizadas, esta sin duda influye sobre la diversidad de los microorganismos revelada por ambos métodos. El incremento en la diversidad observado en análisis de los perfiles genéticos puede deberse al incremento en la cantidad de nichos ecológicos, debido a una mejora nutricional para la biota. Dicha mejora permitiría el incremento en cantidad o permanencia de organismos menos competitivos en el sistema. Desde el punto de vista funcional, existe una tendencia hacia una mejor agrupación de los integrantes de las comunidades de los lotes fertilizados. Sin embargo el análisis realizado no es lo suficientemente detallado para vincular, con seguridad, las tendencias observadas a algún factor.
Es inevitable la utilización de metodologías independientes y complementarias para el estudio de las comunidades microbianas. El suelo es un ambiente muy complejo y no puede ser explicado con un enfoque simple. Por ejemplo, el método DGGE es uno de los más usados para caracterizar las comunidades microbianas. Esta técnica, si bien, posee una aceptable resolución, solamente capta a los miembros predominantes de una comunidad (Nannipieri et al., 2003), sin reflejar la verdadera complejidad del sistema y subestimando la diversidad (Muyzer et al., 1993; Nannipieri et al., 2003). La metodología CLPP, también ha recibido críticas, sobre todo, por ser una técnica dependiente del cultivo. No obstante, puede ser un buen complemento para las metodologías moleculares, como la DGGE (Nannipieri et al., 2003).
 
CONCLUSIÓN
Las metodologías aplicadas resultaron adecuadas para detectar efectos de manejo sobre las comunidades microbianas de los suelos analizados. El impacto de la fertilización fue detectado por ambas metodologías. Ésta resultó determinante para la estructura genética de la microbiota, siendo la labranza el factor secundario, al menos para los casos de SD y LC.
Suelos con labranza convencional mostraron menores niveles de dispersión en su estructura genética con o sin la aplicación de fósforo. Los resultados del análisis por metodología CLPP, en cambio, solamente revelaron una tendencia de agrupación en ausencia de fertilización fosforada y nitrogenada para el caso de maíz.
La vinculación de estudios de estructura genética de las comunidades microbianas con aquellos, que permiten analizar sus funciones, dispone de la ventaja de interpretar mejor un ambiente tan complejo como el suelo. La aplicación de una sola metodología otorgaría información incompleta imposibilitando una adecuada comprensión de la diversidad presente.
 
BIBLIOGRAFÍA
Anderson TH (2003) Microbial eco-physiological indicators to asses soil quality. Agric Ecosys Environ 98: 285-293.
Bastida F, Zsolnay A, Hernandez T, Garcia C (2008) Past, present and future of soil quality indices: A biological perspective. Rewiev, Geoderma 147: 159-171.
Correa OS, Romero AM, Montecchia MS, Soria MA (2007) Tomato genotype and Azospirillum inoculation modulate the changes in bacterial communities associated with roots and leaves. Journal of Appl Microbiol 102: 781-786.
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Heuer H, Krsek M, Baker P, Smalla K, Wellington E (1997) Analysis of actinomycete communities by specific amplification of gene encoding 16S rRNA and gel-electrophoretic separation in denaturing gradients. Appl Environ Microbiol 63: 3233-3241.
Lupwayi NZ, Rice WA, Clayton GW (1998) Soil microbial diversity and community structure under wheat as influenced by tillage and crop rotation. Soil Biol and Biochemistry 30: 1733-1741.
Montecchia MS, Correa OS, Puches NL, Kerber NL, Garcia AF (2007) Microbial diversity in pristine, deforested and agricultural soils from the Yungas in Argentina. 43th Annual Metting argentine Society for Biochemestry and Molecular Biology. Mar del plata, Argentina. BIOCELL 31: MI-P21, p. 56. ISSN 0327 9545.
Montecchia MS, Correa OS, Soria MA, Garland JL, Pucheu NL, García AF (2008) A polyphasic study of the microbial community structure in soils from northwestern Argentina. XLIV Annual Meeting- Argentine Society for Biochemistry and Molecular Biology Research. Villa Carlos Paz, Córdoba, Argentina. Libro de resúmenes, p102. ISSN 0327 9545.
Montecchia MS, Correa OS, Soria MA, Garland JL, García AF (2009) Análisis de las comunidades microbianas de suelos prístinos y bajo monocultivos en la ecorregión de Las Yungas del noroeste argentino. XXIV Reunión Latinoamericana de Rhizobiología (XXIV RELAR) y la conferencia Iberoamericana de interacciones beneficiosas microorganismos-planta-ambiente (I IBEMPA). La Habana, CUBA.
Montecchia MS, Correa OS, Soria MA, Frey SD, Garcia AF, Garland JL (2011) Multivariate approach to characterizing soil microbial communities in pristine and agricultural sites in Northwest Argentina. Appl Soil Ecol 47: 176-183.
Muyzer G, de Waal EC, Uitterlinden AG (1993) Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding 16S RNA. Appl Environ Microbiol 59: 695-700.
Nannipieri P, Ascher J, Ceccherini MT (2003) Microbial diversity and soil functions. European Journal of Soil Science 54: 655–670.
Ritz K, Black HIJ, Campbell CD, Harris JA, Claire Wood C (2009) Selecting biological indicators for monitoring soils: A framework for balancing scientific and technical opinion to assist policy development. Ecol Indicators 9: 1212-1221.
Ruiz DE, Montecchia MS, Correa OS, Pucheu NL, Soria MA, García AF (2008) Characterization of pristine and agricultural soils by catabolic profiling of microbial communities XLIV Annual Meeting-Argentine Society for Biochemistry and Molecular Biology Research Villa Carlos Paz, Córdoba, Argentina
Zak DR, Holmes WE, White DC, Peacock AD, Tilman D (2003) Plant diversity, soil microbial communities, and ecosystem function: are there any links? Ecology 84: 2042–2050.
Zwart G, Bok J (2004) Protocol DGGE. Department of Microbial Ecology, Center for Limnology, Netherlands Institute of Ecology (NIOO-KNAW).
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Autores:
Oksana Sydorenko
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Martín Díaz Zorita
Fertilizar Asociación Civil
16 de julio de 2012
los cultivos utilizados en este estudio son maiz y soja en rotacion continua de larga duracion
Alfredo Aragones Rios
Biogen SRL (Perú)
27 de septiembre de 2012
Efectivamente el efecto de la fertilización tiene un efecto directo sobre las comunidades microbianas y esto un efecto directo en el desarrollo del cultivo. Sin embargo la diversidad taxonómica de los suelos es muy amplia y difícil de estudiar, no tenemos mayor referencia de la actividad de protozoos por decir un caso, y en los estudios de suelos siempre hay una gama de microorganismos de este tipo que cumplen alguna función en el ecosistema suelo, también rotíferos y nematodos del género Heterorhabditis que también participan ciclos tróficos del suelo. Nos falta mucho por desarrollar para entender las dinámicas poblacionales del ecosistema suelo y su aprovechamiento en la explotación agrícola. Muy buen artículo, saludos..
Ing° Alejandro Neira
Biofix
7 de agosto de 2012
Comparto la opinón y los conceptos del Nutriólogo Eduardo Requena, en su comentario del 12/07/12
Alfonso Hidalgo
16 de julio de 2012
saludos trabajo. soy alfonso hidalgo de venezuela ing.agronomo, es muy interesante este trabajo quisiera saber si utilizaron algun cultivo en especial en los suelos bajo estudio y como afecrto sus comportamiento y rendimientos,
Eduardo Requena
Laboratorio Bio-Sol
12 de julio de 2012
DESDE MI PUNTO DE VISTA , NO VEO CLARO EL OBJETIVO DEL TRABAJO,Y ME PARECE QUE ESTO HACE CONFUSA LA CONCLUSIÓN, CREO QUE A ESTE TRABAJO, AFINANDO EL OBJETIVO SE LE PUEDEN SACAR VARIOS DATOS INTERESANTES.
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